施用化学氮肥对粮食产量的提高起着重要的作用，是提高农作物产量最迅速、最有效的方法之一。据联合国粮食与农业组织（FAO）统计^[1]，全球化学氮肥2015年消费总量达到N 1.09×10⁸t，其中中国消费3.10×10⁷t，占全球总消费的28.5%，较1978年的7.5×10⁶t增加3.15倍。化学氮肥在增加粮食产量的同时，亦对全球环境如温度（温室效应^[2]）、土壤（酸化^[3]）、生态环境（面源污染^[4]）等方面产生重要影响。此外，长期大量的化学氮肥施用对土壤物理、化学、生物性质产生影响^[5-9]，进而影响到土壤微生物群落多样性。有研究表明，长期化学氮肥施用降低了旱地土壤真菌的丰度和多样性^[10]，增加了水稻土细菌的丰度和多样性^[11-12]，同时也改变了不同生态系统的细菌和真菌群落结构^{[10, 13]}。

绿肥是一种养分完全的生物肥源，也是目前化学肥料零增长计划和土壤有机质提升计划的重要替代肥源，对农业的可持续发展有着重要意义。研究表明，绿肥可促进后茬作物（小麦）生长并提高产量，提供大量的碳源和养分，改善土壤物理、化学和生物学性状，缓解化肥资源紧张并节约化肥投入成本^[14]。同时，绿肥也改变了土壤细菌多样性及群落组成^[15]。

黄土高原旱地是我国西北地区重要的耕地资源，但土壤全氮含量和有机质含量相对较低，其中有机质含量平均值仅有1.1%^[16]，且超过1/2的土壤有机质含量低于1%。在此条件下，为了提高作物产量，化学氮肥往往会过量施用^[17]，利用绿肥部分替代化肥既可以培肥又可以改善土壤性质和替代部分化肥^[14]，是提高作物产量的重要措施之一。但在此区域，关于长期化学氮肥和绿肥施用对土壤的生化性质、微生物多样性及其功能的研究相对较少。因此，本研究基于8年的定位试验，利用高通量测序技术研究分析了化学氮肥和绿肥施用对土壤细菌多样性及其功能的影响，以期为该区域旱地土壤肥料管理提供一定依据。

试验地位于渭北旱塬雨养农业区陕西省长武县丁家镇十里铺村（35°12′N，107°45′E，海拔1 200 m）。该地区年均气温9.1℃，年均降水量579 mm，降水主要集中在7-9月，占全年降水量的50%~60%。试验区地势平坦，供试土壤为黑垆土，母质为中壤质马兰黄土。定位试验开始时耕层土壤（0~20 cm）基本理化性质为：pH 8.17、容重1.35 g cm^-3、有机碳8.52 g kg^-1、全氮0.78 g kg^-1、硝态氮13.1 mg kg^-1、有效磷（Olsen-P）4.5 mg kg^-1、速效钾129.6 mg kg^-1。

试验开始于2008年9月，以冬小麦为研究作物，一年一季，于9月底播种、翌年6月底收获。设置3个处理：对照（CK）、化学氮肥（FP）、氮肥+绿肥（FGM）。其中CK处理仅施过磷酸钙（P₂O₅105 kg hm^-2a^-1），FP处理施用尿素（N 150 kg hm^-2a^-1）与过磷酸钙（P₂O₅105 kg hm^-2a^-1），FGM处理化肥施用量同FP，并于小麦收获后不施肥硬茬播种绿肥（大豆，地方品种），播种量75 kg hm^-2，下季小麦播前2周将绿肥打碎后翻压入土壤，耕深为30 cm。所有处理的秸秆在冬小麦收获后移出小区，不还田。冬小麦品种为长武521，播种密度为150 kg hm^-2，行距20 cm。小区面积6 m×22 m=132 m²。每处理重复4次，采用完全随机区组试验设计。冬小麦整个生育期不灌水，田间管理与当地农户一致。

于2016年9月18日小麦播种前随机选取各处理3个区组，按五点采样法采集耕层0~20 cm的土样，混匀后立即带回实验室，去除根系等杂物后分为3部分：一部分土样作为鲜土用来测定土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮、可溶性有机碳、可溶性有机氮、土壤矿质氮（硝态氮和铵态氮）；一部分–80 ℃冷冻保存用于测定细菌多样性；一部分土样经过风干后过筛，用于土壤理化性质测定。土壤pH、有机碳、矿质氮采用常规方法测定^[18]。土壤微生物生物量氮、微生物生物量碳采用氯仿熏蒸-K₂SO₄提取法测定^[19-20]。可溶性有机氮、可溶性有机碳采用0.5 mol L^-1 K₂SO₄提取后利用碳自动分析仪、流动分析仪测定。

称取0.3g土壤样品，采用CTAB改进方法对土壤样本基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1 mgL^-1。以稀释后的基因组DNA为模板，使用带Barcode的特异引物（515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′），利用Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer（New England Biolabs公司）和高效高保真酶对细菌V4区进行PCR。PCR反应程序为98 ℃预变性1 min；30个循环为（98 ℃，10 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s）；然后72 ℃，延伸5 min（所用仪器为Bio-rad T100梯度PCR仪）。PCR产物使用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，然后根据PCR产物浓度进行等量混样，充分混匀后使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带使用胶回收试剂盒（Qiagen公司）回收产物。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit（Illumina公司）建库试剂盒进行文库构建，经Qubit和Q-PCR定量合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序（委托北京诺禾致源科技股份有限公司测定）。

测序后的序列按照标准方法处理后，利用Uparse软件（Uparse v7.0.1001）对样品有效序列进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为OTU（基本分类单元）。然后对OTU序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA（Release128，http://www.arb-silva.de/）的SSUrRNA数据库进行物种注释分析，获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。然后利用Qiime软件（Version 1.7.0）计算基本分类单元数、丰度指数（Chao1指数）和多样性指数（Shannon指数），利用R软件（Version 3.2.5）和相关软件包进行细菌群落组间差异分析（主坐标分析、非度量多维尺度分析和Anosim分析）、组间差异物种分析和细菌功能预测分析（FAPROTAX（http://www.zoology.ubc.ca/louca/FAPROTAX）、Tax4Fun（http://tax4fun.gobics.de/））。其他数据采用Excel 2016、DPS（v7.05）进行处理分析，多重比较采用LSD法，显著性水平为α=0.05。

化学氮肥和绿肥施用对旱地麦田土壤性质有不同影响（表 1）。与对照（CK）相比，化学氮肥处理（FP）仅显著增加了土壤有机碳含量（8.0%），而对其他土壤性质均无显著性影响。氮肥+绿肥处理（FGM）显著增加了土壤有机碳（20.0%）、微生物生物量碳（62.0%）、微生物生物量氮（35.9%）、可溶性有机碳（7.27%）和可溶性有机氮（56.3%）含量，而对土壤硝态氮和铵态氮含量无显著性影响。

表 1 Table 1

表 1 不同处理条件下土壤生物化学性质 Table 1 Biochemical properties of the soil relative to treatment 处理 Treatment 有机碳SOC （g kg-1） 硝态氮 NO3--N （mg kg-1） 铵态氮 NH4+-N （mg kg-1） pH 微生物生物量碳MBC （mg kg-1） 微生物生物量氮MBN （mg kg-1） 可溶性有机碳DOC （mg kg-1） 可溶性有机氮DON （mg kg-1） CK 6.96c 5.25a 0.29a 8.23a 118.5b 40.53b 156.9b 2.84b FP 7.52b 5.70a 0.36a 8.09a 135.0b 37.91b 155.9b 2.60b FGM 8.36a 6.66a 0.39a 8.18a 192.0a 55.09a 168.3a 4.44a   注：CK，对照；FP，化学氮肥；FGM，化肥+绿肥。同一列中字母不同表示处理之间差异达到显著水平（p < 0.05, n=3）。下同Note:CK: control; FP: applied with N fertilizer; FGM: FP plus green manure. Different letters in the same column indicate significant difference between treatments at 0.05 level（n=3）. The same below

表 1 不同处理条件下土壤生物化学性质 Table 1 Biochemical properties of the soil relative to treatment

高通量测序后获得691 724条有效序列，CK、FP和FGM处理的平均有效序列分别为76 689、80 774、73 112。经过与数据库比对注释后，共获得34 134个OTU（基本分类单元），CK、FP和FGM的平均OTU数为3 792，各处理之间无显著性差异（表 2）。细菌群落丰度指数（Chao1）和多样性指数（Shannon）各处理之间均无显著性差异。说明与对照相比，化学氮肥和绿肥施用并未显著改变细菌群落丰度及多样性。

表 2 Table 2

表 2 不同处理细菌群落丰度与多样性指数 Table 2 Bacterial community richness (OTU number) and diversity indices (Chao1, Shannon) relative to treatment 处理 Treatment 基本分类单元数OTU number Chao1指数 Chao 1 index 香农指数 Shannon index CK 3 678a 4 086a 9.77a FP 4 021a 4 489a 9.94a FGM 3 679a 3 951a 9.84a

表 2 不同处理细菌群落丰度与多样性指数 Table 2 Bacterial community richness (OTU number) and diversity indices (Chao1, Shannon) relative to treatment

细菌16S rDNA高通量测序序列经物种注释后共获得49个门、101个纲、200个目、360个科和552个属类细菌。在门和属水平上，细菌群落组成如图 1所示。可以看出在门水平，CK、FP和FGM处理的相对丰度 > 1%的细菌分别占总细菌总数的95.0%、94.5%和94.3%。CK、FP和FGM各处理的菌群相对丰度无显著性差异，其中优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），各处理的平均相对丰度分别为35.6%、18.6%、12.6%、7.2%和6.7%。在属水平上，CK、FP和FGM各处理相对丰度≥0.5%的属占总细菌属的15.6%、13.3%和13.8%，其中优势细菌属为鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、乳酸菌属（Lactobacillus）、节杆菌属（Arthrobacter）、Haliangium和Gaiella，各处理平均相对丰度分别为3.5%、0.8%、1.1%、1.2%和0.9%。这些优势菌群属中，仅有乳酸菌属（Lactobacillus）在CK、FP和FGM处理中存在显著性差异，即FGM处理显著低于CK和FP处理。此外，有部分其他细菌属（相对丰度 < 0.5%）在CK、FP、FGM处理之间存在着显著性差异（表 3），说明化学氮肥和绿肥施用显著改变了土壤细菌在属水平上的群落组成。但从整体来看，排序分析（图 2）和Anosim分析（p（CK-FP）=1；p（CK-FGM）=1；p（FP-FGM）=0.7）均表明CK、FP、FGM处理之间的细菌群落结构并无显著性差异，说明化学氮肥和绿肥施用并未改变土壤的细菌群落结构。

图 1 不同处理条件下土壤细菌在门水平（A）和属水平（B）上的优势物种丰度图 Fig. 1 Dominant species abundance map at the phylum(A) and genus (B)levels relative to treatment

表 3 Table 3

表 3 不同处理间相对丰度达到差异显著的细菌属（相对丰度 > 0.1%）列表 Table 3 List of soil bacterial genera (with abundance > 0.1%) with significant difference between treatments CK-FP处理之间 Between CKandFP CK-FGM处理之间 Between CK and FGM FP-FGM处理之间 Between FP and FGM Pseudoduganella Steroidobacter Adhaeribacter Nordella Ralstonia Steroidobacter Chryseolinea Lentzea Chitinophaga Lysobacter Steroidobacter Adhaeribacter Chryseolinea Roseiflexus Lentzea Chitinophaga

表 3 不同处理间相对丰度达到差异显著的细菌属（相对丰度 > 0.1%）列表 Table 3 List of soil bacterial genera (with abundance > 0.1%) with significant difference between treatments

图 2 基于主坐标（PCoA）（A）和非度量多维尺度（NMDS）（B）的群落结构分析 Fig. 2 The principal coordinate analysis (PCoA) (A) and non-metric multi dimensional scale (NMDS) analysis (B) of soil microbial community structures relative to treatment

根据16S序列的分类注释结果采用FAPROTAX工具对微生物群落功能注释后共获得63种功能分组，这些功能菌群包含1301个OTU，占全部OTU的16.3%，而其序列数占总序列数的27.7%。相对丰度较高的功能分组信息如图 3所示。可以看出，化能异养（包括chemoheterotrophy和aerobic chemoheterotrophy）、硝化作用（nitrification）、氨氧化作用（aerobic ammonia oxidation）、亚硝酸盐氧化作用（aerobic nitrite oxidation）、硝酸盐还原作用（nitrate reduction）功能类细菌相对丰度较高，分别占总细菌群落的14.9%、3.3%、2.0%、1.2%和1.1%。采用Tax4Fun功能预测工具对微生物群落功能注释后共获得41种二级（Level 2）功能分组和271种三级（Level 3）功能分组，其相对丰度排名前10的功能分组如图 4所示。可以看出二级和三级分组中优势功能菌群的相对丰度在CK、FP、FGM各处理中均无显著性差异。绿肥C/N比相对较低，还田后易被微生物快速分解，但分析数据表明参与碳氮代谢的微生物功能菌群（包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢、氮代谢、氮循环等功能菌群）（图 3和图 4）在各处理之间并无差异，说明在本研究条件下绿肥施用并未改变土壤微生物功能。

图 3 不同处理条件下基于FAPROTAX预测的细菌功能分组丰度图 Fig. 3 Abundance of soil bacterial function groups predicted with the FAPROTAX tool relative to treatment

图 4 不同处理条件下基于Tax4Fun预测的细菌功能分组丰度图（A.二级功能分组，B.三级功能分组） Fig. 4 Abundance of soil bacterial function groups predicted with the Tax4Fun tool relative to treatment(A.functional groups at level 2, B. functional groups at level 3)

本研究表明多年化学氮肥施用显著提高了旱地土壤有机碳的含量，而对土壤微生物生物量氮、微生物生物量碳、可溶性有机氮、可溶性有机碳含量无显著影响（表 1），而王慧等^[6]研究表明在黄土高原南部旱地，与对照相比，长期化学氮肥施用除了显著增加旱地土壤有机碳含量外，还显著提高了土壤有机氮、微生物生物量氮含量。此外，化学氮肥施用提高了玉米-小麦轮作体系土壤有机碳和有机氮含量^[5]、潮土有机氮含量^[8]、淮河中游水稻土^[9]和黄淮海平原潮土^[7]土壤微生物生物量碳氮含量。同时也有研究表明化学氮肥施用对旱地土壤有机碳、微生物生物量碳含量无显著性影响^[21]。可以看出，化学氮肥施用对不同生态区土壤生物化学性质影响不一，与不同区域土壤性质与气候有关。

与化学氮肥施用处理不同，氮肥+绿肥处理显著提高了土壤有机碳、微生物生物量氮、微生物生物量碳、可溶性有机氮、可溶性有机碳（表 1）。与处于该区域的绿肥研究结果一致^[22-24]，他们研究也表明在化学氮肥施用基础上种植绿肥翻压后土壤有机碳、微生物生物量碳含量较只施用化学氮肥处理显著提高。此外，冬闲期间绿肥作物种植（紫云英、油菜和黑麦草）显著提高了湖南祁阳红壤水稻土土壤有机质、全氮和碱解氮含量^[25-26]；夏闲期间种植绿肥（籽粒苋）翻压后同样在一定程度上提高了河北廊坊日光温室蔬菜大棚土壤可溶性有机碳、有机氮含量^[27]。由此可知，种植绿肥处理可改善不同生态系统土壤性质，提高土壤肥力。

化学氮肥施用对不同生态系统土壤细菌多样性及群落组成有不同的影响^{[10, 28-31]}。本研究中，与对照相比，化学氮肥施用处理并未显著改变旱地土壤的细菌多样性（表 2），与Koyama等^[32]在美国北极苔原（Arctic tundra）和Shi等^[30]在我国黑土土壤上的研究结果一致。同时亦有研究表明化学氮肥施用显著提高^[12]或降低了土壤细菌多样性^{[10, 28, 33]}。研究结果的差异可能与不同生态区土壤性质如有机碳、pH等因素有关。本研究中，土壤有机碳含量相对较低，尽管氮肥施用提高了土壤有机碳含量，但该土壤有机碳的绝对值相对较低（如对照处理仅有6.96 mg kg^-1），有机质含量的提高不足以改变土壤细菌丰度及多样性。而在我国东北的黑土上，土壤有机碳含量相对较高（15.8 mg kg^-1），氮肥施用也提高了土壤有机碳含量，但其细菌多样性反而下降，这与氮肥施用降低了土壤pH密切相关^[33]。此外，化学氮肥施用处理还会影响到土壤中细菌群落组成。本研究中，化学氮肥施用处理未改变细菌门水平的群落组成（图 1A），但改变了属水平的群落组成（图 1B），与Zhong等^[10]研究结果一致，说明在黄土高原旱地，氮肥包括绿肥的合理使用对土壤微生物的多样性影响较小。

与化学氮肥施用不同，现有多数研究均表明绿肥施用处理可增加土壤中细菌的丰度和多样性。如绿肥施用处理显著增加了黄土高原旱区土壤中微生物总数、细菌和放线菌数量^[34]，明显提高了湖北山地黄棕壤中细菌及微生物总的磷脂脂肪酸（PLFAs）含量（即微生物总数）^[35]，显著增加了湖南红壤性水稻土细菌群落丰度与多样性^[23]和湘西烟田土壤细菌群落多样性，其中黑麦草绿肥还田处理提高幅度最大^[36]。此外，绿肥施用也改变了细菌群落组成，如在湘西烟田中，绿肥施用增加了变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）相对丰度^[36]；在湖南红壤性水稻土上，绿肥施用改变了变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）和浮霉菌门（Planctomycetes）的相对丰度^[23]。而在本研究中，绿肥施用并未显著影响到细菌的丰度、多样性（表 2）以及门水平的细菌群落相对丰度（图 1），仅改变了在属水平的细菌群落相对丰度（图 1、表 3）。研究结果的差异可能与不同生态区土壤性质和气候等因素有关。

细菌在土壤养分循环中起着重要作用，其功能在一定程度上决定土壤肥力高低，但同时易受外界环境条件如施肥的影响。李晓慧^[37]研究表明长期施氮肥导致了东北黑土土壤中氨氧化古菌丰度的下降和功能的退化，以及氨氧化细菌丰度的增加和功能的强化；卞碧云^[38]研究表明长期高量施氮肥（N870、N696）明显降低了太湖地区设施栽培蔬菜地土壤氨单加氧酶功能基因（amoA）的数量，导致土壤氨氧化作用显著降低，主要是由土壤酸化引起的。此外，绿肥施用也可在一定程度改变土壤中细菌功能，袁秀梅^[39]研究表明蚕豆绿肥覆盖或翻压均促进了土壤固氮功能细菌、氨化作用细菌、硝化作用细菌和反硝化作用等功能细菌数量的增长，即绿肥施用促进了土壤的固氮作用和氮素转化过程。但在本研究中，与对照相比，化学氮肥和绿肥施用并未改变土壤中参与氮循环功能（如氮代谢、氨基酸代谢、氨氧化作用、硝化作用等）、碳代谢功能（如碳水化合物代谢、维生素代谢、淀粉和蔗糖代谢等）和其他功能细菌相对丰度（图 3和图 4），这与不同研究中的土壤性质和生态条件差异有关，亦可能与土壤细菌空间变异和高通量测序分析变异较大有关，导致处理之间变异较大，差异不显著。

与对照相比，化学氮肥处理可显著增加土壤有机碳含量，而氮肥+绿肥处理显著提高了土壤有机碳、微生物生物量碳、微生物生物量氮、可溶性有机碳和有机氮含量。化学氮肥和绿肥施用并未显著影响细菌群落丰度、多样性，未改变在门水平上的细菌群落组成以及主要功能基因细菌相对丰度，但改变了细菌在属水平的群落组成。因此，化学氮肥和绿肥施用对该区域旱地土壤的细菌多样性、群落组成和功能影响相对较小，但可在一定程度上提高土壤肥力。