农田生态系统中，磷素是作物生长发育中仅次于氮素的第二重要养分。砂姜黑土占淮北平原耕地面积的2/3，土壤中磷含量及有效性不足，严重制约着砂姜黑土区农作物生产，是典型的中低产田^[1]。施用磷肥是提高作物产量和提升土壤肥力的重要农业措施，前人对砂姜黑土长期定位试验进行了大量研究，结果发现长期施用磷肥可明显提高作物产量、养分含量和土壤酶活性^[2-5]。但是农民基于经济因素，磷肥的施用并非全部足量，存在不同磷肥施用梯度^[6]。然而在砂姜黑土区关于不同磷肥施用梯度对土壤养分和作物产量尚未展开系统研究。

土壤微生物是农田生态系统的重要组成部分，在维持生态系统结构和功能稳定性中发挥重要作用，其在土壤养分循环、有机质降解、团聚体形成等生物化学过程中均扮演着重要角色^[7]。然而关于施用磷肥对微生物群落影响的研究并没有一致的结论。一些研究表明施用磷肥可提高土壤有效磷含量从而改变土壤微生物群落结构和组成并会促进某些特定微生物的生长^[8]。比如Tan等^[9]经过42年不同磷肥施用梯度(不施磷肥、P₂O₅ 15 kg·hm^-2和P₂O₅ 30 kg·hm^-2)处理后，发现随着磷肥施用量的增加，土壤细菌多样性以及土壤中溶磷细菌的相对丰度也随之增加，但酸杆菌门(Acidobacteria)和假单胞菌属(Pseudomonas)等细菌相对丰度则随之降低。研究者认为磷肥施入土壤后可通过增加养分有效性、改变土壤pH和渗透势等多种途径影响土壤微生物^[10]; 然而还有一些研究发现长期施用磷肥对土壤微生物群落的影响很小。比如Shi等^[11]发现经过17年不同磷肥施用梯度(不施磷肥、P₂O₅ 17.5 kg·hm^-2和P₂O₅ 35 kg·hm^-2)后，土壤细菌群落结构并未发生显著改变。这些研究者认为虽然土壤中有效磷含量较低，但C和N仍为土壤微生物主要生长限制因素^[12]。因此关于施用磷肥对土壤微生物群落影响机制仍存在着广泛的不确定性^[13]。

本研究以典型砂姜黑土区-安徽蒙城氮磷钾肥肥效长期定位试验为平台，选取P0(不施磷肥)、P1(P₂O₅ 45 kg·hm^-2)和P2(P₂O₅ 90 kg·hm^-2)3个磷肥施用梯度，采用现代高通量测序技术，测定经过21年连续不同磷肥施用梯度后，土壤细菌多样性及群落组成变化，以探索土壤细菌群落组成与土壤肥力指标及土壤酶活性的关系，为砂姜黑土区科学施用磷肥提供理论依据和科学支持。

田间长期肥料定位试验始于1994年，位于农业部蒙城砂姜黑土生态环境站内(33°13′N，116°35′E)。该地属暖温带半湿润季风气候，年均气温14.8℃，年均降水量872.4 mm。试验共设置9个处理，本研究选取其中3个处理，即：(1)P0(不施磷肥); (2)P1(P₂O₅ 45 kg·hm^-2); (3)P2(P₂O₅ 90 kg·hm^-2)。除磷肥施用差异外，所有处理氮肥和钾肥施用量一致，其中N 187.5 kg·hm^-2，K₂O 135 kg·hm^-2。氮肥为尿素，磷肥为普钙，钾肥为氯化钾。小区面积19 m²，3次重复，完全随机区组设计。所有肥料均在小麦播种时一次基肥施入，后茬作物不施肥。试验样地1994-1998年为小麦玉米轮作，1998-2015年为小麦大豆轮作。

试验样品于2015年6月小麦成熟期时采集，即截止样品采集时，各处理已经历总共21年不同施肥处理。按照S采样法，每个小区使用土钻(直径5 cm)采集9份0~15 cm表层土样，混合成一个样品。所有样品置于冰袋中运回实验室。土样去除大的植物根系和石块后过2 mm筛。所有样品分为三部分，一部分风干后用于理化性质测定，一部分置于4℃冰箱用于土壤酶活性的测定，另一部分置于-80℃用于DNA提取。

土壤理化性质均采用土壤常规分析方法^[14]测定。土壤pH按土水比1︰5(质量体积比)充分混合后用pH计测定; 土壤有机碳(SOC)采用重铬酸钾氧化外加热法测定; 土壤全氮(TN)采用半微量开氏法测定; 全磷(TP)和有效磷(AP)采用钼锑抗比色法测定; 可溶性有机碳(DOC)采用土水比1︰5(质量体积比)充分振荡30 min后，上清液过0.45 μm滤膜，滤液用有机碳分析仪测定; 土壤硝态氮(NO₃^--N)和铵态氮(NH₄⁺-N)采用2 mol·L^-1的KCl提取，硝态氮采用双波段比色法，铵态氮采用靛酚蓝比色法测定。土壤酶活性^[15]采用鲜土测定：β-葡糖苷酶采用对硝基酚比色法; 蛋白酶采用络氨酸比色法; 酸性磷酸酶采用对硝基笨磷酸盐法; 脱氢酶活性测定参考Tabatabai^[16]方法测定。土壤生化指标结果均以烘干土(105℃，24 h)为基准表达。

土壤DNA采用Fast DNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)试剂盒提取。每个样品称取0.50 g鲜土，按照说明书操作提取DNA。

选取细菌16S rRNA基因的V4-V5区进行高通量测序测定。PCR扩增采用特异性引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)/907R(5′-CC GTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。每个样品前端引物均含有不同的7 bp Barcode用于区分不同样品。PCR扩增条件包括94℃ 5 min; 90℃ 60 s，55℃ 60s，72℃ 75 s，30个循环，之后72℃ 10 min。反应产物采用QIA quick PCR Purification kit (Qiagen)进行纯化。将不同样品的PCR扩增产物等摩尔混合后，采用Illumina公司MiSeq测序仪完成序列分析(委托上海派森诺生物科技股份有限公司测定)。

高通量测序所得序列按照以下步骤进行分析：(1)双端序列采用FLASH^[17]进行拼接; (2)使用Cutadapt^[18]切除引物; (3)采用QIIME(1.91)^[19]去除质量分数低于20，序列短于300 bp的低质量序列; (4)采用RDP^[20]数据库去除嵌合体; (5)得到的高质量序列采用Uparse^[21]软件，以97%相似度进行OTU划分，采用Blast方法以Greengeens13.8数据库为比对进行注释。将未注释到门水平及注释为古菌的序列删除后，所有样品随机抽取10 000条序列进行后续分析。细菌香农指数在QIIME中计算。基于Bray-Curtis距离的PCoA、CAP和Adonis分析均使用R 2.15.3软件的vegan包进行。采用mvpart和MVPARTwrap包进行多元回归树(MRT)分析。使用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，相关性分析采用Pearson双尾检验; 平均值多重比较采用邓肯新复检验法(Duncan’s New Multiple Range Test)进行显著性检验(P < 0.05)。采用Microsoft Excel 2007和Origin 8.0软件进行数据处理和绘图。

由表 1可知经过21年不同磷肥施用梯度后土壤理化性质发生明显变化。土壤有机碳、铵态氮和有效磷含量在P2处理中显著升高(P < 0.05)，分别较P0处理提高10.33%、79.49%和384.19%，较P1处理提高7.65%、65.68%和98.42%。全磷、可溶性有机碳和碳氮比在不同处理间均按照P0 < P1 < P2的顺序升高，其中P2和P1处理全磷含量较P0处理分别提高40.00%和12.90%，可溶性有机碳含量分别提高31.36%和13.63%，而碳氮比分别提高12.74%和8.54%。硝态氮、碳磷比和氮磷比在P0处理中均显著高于P1和P2处理，而在P1和P2处理间没有显著差异。本试验条件下长期不同磷肥施用量对土壤pH和TN均没有显著影响(P > 0.05)。

表 1 Table 1

表 1 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土理化性质的变化 Table 1 Physico-chemical properties of the lime concretion black soil relative to P application rate 处理 Treatment pH 土壤有机碳 SOC/(g·kg-1) 全氮 TN/(g·kg-1) 全磷 TP/(g·kg-1) 可溶性有机碳 DOC/(mg·kg-1) 铵态氮 NH4+-N/(mg·kg-1) 硝态氮 NO3--N/(mg·kg-1) 有效磷AP/(mg·kg-1) 碳氮比 C︰N 碳磷比 C︰P 氮磷比 N︰P P0 5.22±0.28a 8.42±0.31b 1.07±0.05a 0.25±0.01c 18.78±0.14c 1.56±0.32b 43.08±5.07a 2.34±0.08b 7.85±0.12b 34.05±1.22a 4.34±0.16a P1 5.43±0.06a 8.63±0.15b 1.01±0.03a 0.31±0.02b 21.71±1.63b 1.69±0.15b 10.44±1.02b 5.71±0.72b 8.52±0.27ab 28.30±2.12b 3.32±0.21b P2 5.53±0.13a 9.29±0.23a 1.05±0.09a 0.35±0.01a 24.67±0.20a 2.80±0.01a 8.06±0.20b 11.33±2.92a 8.85±0.50a 26.46±0.54b 3.00±0.23b 注：平均值±标准差(n=3)，不同字母表示在处理间显著差异(Duncan法，P < 0.05)。下同Note: Means ± standard deviation (n=3). Different letters indicate significant differences between fertilization treatments (Duncan method, P < 0.05). The same below

表 1 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土理化性质的变化 Table 1 Physico-chemical properties of the lime concretion black soil relative to P application rate

为了检验施用磷肥对土壤微生物功能的影响，分别测量β-葡糖苷酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和脱氢酶等4种胞外酶活性(图 1)。随着磷肥施用量增加，所测4中酶活性均有增加的趋势，但只有蛋白酶和脱氢酶活性在不同磷肥施用梯度间达到统计学上的差异显著水平，P2和P1处理蛋白酶较P0分别升高68.31%和41.55%，脱氢酶分别升高16.48%和4.39%;β-葡糖苷酶在P2和P1处理间差异不显著，但分别较P0高70.78%和51.22%;酸性磷酸酶在不同磷肥水平间均没有达到差异显著水平。

注:图中误差线为标准差(n=3)，不同字母表示在处理间显著差异(Duncan法，P < 0.05)。下同Note: The error bars represent standard deviation (n =3). Different letters indicate significant differences between fertilization treatments (Duncan method, P < 0.05). The same below 图 1 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土酶活性的变化 Fig. 1 Soil enzyme activities in the lime concretion black soil relative to P application rate

对9个样品(3个处理，每个处理3个重复)进行MiSeq高通量测序。经过质量控制，总共得到108 759条高质量序列(每个样品10 187~15 169条序列)。以97%相似度与数据库比对注释后，共获得655个OTU，这些OTU归属于228个属、188个科、120个目、69个科和23个门。以香农指数表征细菌群落多样性，结果发现(图 2a)，随着磷肥的施入，细菌多样性显著升高; 相关性分析(图 2b)表明细菌多样性与DOC和TP均成显著正相关(r=0.89，P=0.001;r=0.93，P=0.001)，因此施用磷肥后DOC和TP含量的增加可能是导致细菌多样性升高的主要原因。

图 2 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土细菌群落α多样性的变化 Fig. 2 Soil bacterial alpha-diversity of the lime concretion black soil relative to P application rate

长期不同磷肥施用梯度可导致细菌群落组成和结构发生明显变化(图 3)。与前人研究结果类似^[22]，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)是砂姜黑土中的优势菌，其相对丰度分别为40.16%、19.75%和14.91%(图 3a)。其余相对丰度大于1%的门主要为绿弯菌门(Chloroflexi，7.20%)、浮霉菌门(Planctomycetes，6.65%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，2.73%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，1.85%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae，1.75%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，1.68%)和厚壁菌门(Firmicutes，1.27%)。对均一化后的OTU表，基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析发现：主坐标分析的前两轴解释了大约75%的总方差，其中第一轴和第二轴分别解释55.24%和18.86%的总方差，各处理按照磷肥施用梯度(P0 < P1 < P2)沿第一轴分开，施肥处理各重复聚集在一起，而不同施肥处理间距较远。同样Adonis分析发现施肥处理对细菌群落结构具有显著影响(r²=0.631，P=0.006)。以上结果说明土壤细菌群落组成和结构在不同磷肥施用梯度下发生明显改变。

图 3 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土细菌群落组成的变化 Fig. 3 Composition of the soil bacterial community in the lime concretion black soil relative to P application rate

通过对各处理中相对丰度最高的前10个门(图 4A)和前15个属(图 4b)进行单因素方差分析，发现不同磷肥施用梯度导致砂姜黑土中特定微生物相对丰度发生改变。与P0处理相比，共有3个门(变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobia))和3个属(Kaistobacter、DA101和Rhodanobacter)细菌相对丰度在P1和P2处理中有不同程度降低; 而4个门(放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes))和3个属(Terracoccus、Flavisolibacter和Arthrobacter)相对丰度在P1和P2处理中不同程度升高。与P0和P1处理相比，P2处理中的Bradyrhizobium和Burkholderia相对丰度显著降低。

图 4 不同磷肥施用梯度下砂姜黑土相对丰度最高的前10个门a)和前15个属b)的变化 Fig. 4 Relative abundances of the top 10 phyla a) and the top 15 genera b) in the lime concretion black soil relative to P application rate

CAP分析(图 5a)表明DOC和TP对第一轴贡献率较高，而NO₃^--N对第二轴贡献率较高; 多元回归树分析(图 5b)总共解释了73.10%的细菌群落变异，细菌群落首先由DOC分为2个大的分支(解释43.15%群落变异)，然后由TP又分为两个分支(解释29.95%群落变异)。MRT分析的三片叶子基本将三个处理分开(除一P2处理归属于第二片叶子)。以上结果说明在不同磷肥施用梯度下，土壤DOC和TP是调控砂姜黑土细菌群落的关键理化因子。

注：SOC：土壤有机碳; TN：全氮; TP：全磷; DOC：可溶性有机碳; NH4+-N：铵态氮; NO3--N：硝态氮; AP：有效磷。下同 Note: SOC: Soil organic carbon; TN: Total nitrogen; TP: Total phosphate; DOC: Dissolved organic carbon; NH4+-N: Ammonium; NO3--N: Nitrate; AP: Available phosphate. The same below 图 5 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土细菌群落结构与土壤理化性质之间关系 Fig. 5 Relationship between soil bacterial community structure and soil physic-chemical properties of the lime concretion black soil relative to P application rate

在门和属水平上，对差异物种与环境因子进行相关性分析，结果如表 2所示。变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及Kaistobacter、DA101、Rhodanobacter等在施磷后相对丰度降低的细菌均与DOC和TP成显著负相关，而与C︰P和N︰P成显著正相关; 酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)以及Terracoccus、Arthrobacter等在施磷后相对丰度升高的细菌则与DOC和TP成显著正相关，与C︰P和N︰P成显著负相关; 拟杆菌门(Bacteroidetes)和Flavisolibacter与NH₄⁺-N相关系数最高，且均达到极显著水平。由上述结果可以看出长期不同磷肥施用梯度下土壤理化性质的变化是导致微生物群落结构发生改变的重要原因。

表 2 Table 2

表 2 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土差异细菌与土壤理化性质相关性 Table 2 Pearson correlation analysis of bacterial variation with soil physicao-chemical properties in the lime concretion black soil relative to P application rate 水平 Level 细菌 Bacteria pH SOC TN TP DOC NO3--N NH4+-N AP C︰N C︰P N︰P 门Phylum Proteobacteria -0.73* ns ns -0.69* -0.72* 0.88** ns ns -0.71* 0.78* 0.82** Chloroflexi ns -0.73* ns -0.82** -0.60* 0.71* -0.75* -0.82** ns 0.71* 0.71* Verrucomicrobia ns ns ns -0.68* ns 0.71* ns ns ns 0.82** 0.79* Actinobacteria ns ns ns ns ns ns ns ns ns -0.69* ns Acidobacteria 0.79* ns ns ns ns -0.80** ns ns ns -0.75* -0.76* Planctomycetes ns ns ns ns ns -0.73* ns ns ns -0.73* -0.69* Bacteroidetes ns 0.78* ns 0.74* 0.79* ns 0.81** 0.67* ns ns ns 属Genus Kaistobacter ns ns ns -0.79* -0.72* 0.93** ns ns -0.73* 0.88** 0.89** DA101 ns ns ns -0.78* -0.68* 0.76* ns ns ns 0.86** 0.84** Rhodanobacter ns ns ns -0.81** -0.76* 0.85** ns ns -0.73* 0.90** 0.91** Bradyrhizobium ns ns ns ns ns ns -0.77* ns ns ns ns Burkholderia ns ns ns ns ns ns ns -0.68* ns ns ns Terracoccus ns 0.84** ns 0.99** 0.88** -0.90** 0.84** 0.92** 0.76* -0.92** -0.91** Flavisolibacter ns 0.73* ns 0.74* 0.78* ns 0.84** 0.75* ns ns ns Arthrobacter ns ns ns 0.85** 0.80** -0.73* 0.75* 0.89** 0.82** -0.83** -0.86** 注:*表示显著相关(P < 0.05);**表示极显著相关(P < 0.01);ns表示相关性不显著(P > 0.05)Note: * indicates significant correlation at 0.05 level; ** indicates significant correlation at 0.01 level; ns indicates no significant correlation (P > 0.05)

表 2 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土差异细菌与土壤理化性质相关性 Table 2 Pearson correlation analysis of bacterial variation with soil physicao-chemical properties in the lime concretion black soil relative to P application rate

在门和属水平上，对差异物种与土壤酶活性进行相关性分析，结果如表 3所示。β-葡糖苷酶和蛋白酶与变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)以及Kaistobacter、DA101、Rhodanobacter等在施磷后相对丰度降低的细菌均成显著负相关，而与酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)以及Terracoccus、Flavisolibacter、Arthrobacter等在施磷后相对丰度升高的细菌成显著正相关。酸性磷酸酶则与拟杆菌门(Bacteroidetes)和Flavisolibacter成显著正相关。脱氢酶与绿弯菌门(Chloroflexi)、Bradyrhizobium和Burkholderia成显著负相关，而与拟杆菌门(Bacteroidetes)、Terracoccus、Flavisolibacter和Arthrobacter成显著正相关。由以上结果可以看出土壤中酶活性的变化与差异物种间存在显著性关联，施用磷肥后土壤酶活性的变化可能与相关功能微生物相对丰度的改变有关。

表 3 Table 3

表 3 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土差异细菌与土壤酶活性相关性 Table 3 Pearson correlation analysis of bacterial variation with soil enzyme activities in the lime concretion black soil relative to P application rate 水平 Level 细菌 Bacteria β-葡糖苷酶 β-glucosidase 蛋白酶 Protease 酸性磷酸酶 Acid phosphatase 脱氢酶 Dehydrogenase 门Phylum Proteobacteria -0.86** -0.77* ns ns Chloroflexi -0.67* -0.76* ns -0.83** Verrucomicrobia -0.69* ns ns ns Actinobacteria ns ns ns ns Acidobacteria 0.76* 0.80* ns ns Planctomycetes 0.68* 0.67* ns ns Bacteroidetes 0.81** 0.84** 0.79* 0.81** 属Genus Kaistobacter -0.89** -0.83** ns ns DA101 -0.79* -0.72* ns ns Rhodanobacter -0.84** -0.72* ns ns Bradyrhizobium ns ns ns -0.69* Burkholderia ns ns ns -0.74* Terracoccus 0.90** 0.90** ns 0.91** Flavisolibacter 0.75* 0.80** 0.70* 0.85** Arthrobacter 0.82** 0.86** ns 0.86**

表 3 三种磷肥施用梯度下砂姜黑土差异细菌与土壤酶活性相关性 Table 3 Pearson correlation analysis of bacterial variation with soil enzyme activities in the lime concretion black soil relative to P application rate

磷素缺乏是砂姜黑土区作物产量低下的重要限制因子，施用磷肥是提高砂姜黑土磷素有效性的有效措施^[3-4]。然而关于长期不同磷肥施用梯度对地下微生物群落的影响尚未展开系统研究。本研究采用现代高通量测序技术，研究经过21年三种不同磷肥施用梯度后，土壤细菌群落多样性及细菌群落组成变化，探索其与土壤肥力指标及土壤酶活性的关系。

与以往的研究结果相同^[9]，长期施用磷肥导致土壤细菌多样性显著升高(图 2a)。Zhong和Cai^[23]认为施用磷肥后土壤养分的升高尤其是有机质含量的增加是导致细菌多样性增加的主要原因。在本研究中施用磷肥后土壤DOC和TP含量显著升高，而相关性分析(图 2b)表明DOC和TP含量均与香农指标成显著正相关(r=0.89，P=0.001; r=0.93，P=0.001)。因此在本研究中长期施磷后DOC和TP含量的升高可能是导致细菌多样性升高的重要原因。

磷肥施入不仅提高了细菌多样性，同时还改变了细菌群落组成和结构。在门水平上，放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度随着磷肥施入而逐渐升高(图 4a)。研究表明这三种细菌在土壤中均具有溶磷作用，在土壤中可将难利用的无机磷和大分子的有机磷转化为作物可吸收利用的磷素形态，其相对丰度随磷肥的加入而升高^[24-26]。在属水平上，Terracoccus、Flavisolibacter和Arthrobacter相对丰度则随着磷肥的施入逐渐升高(图 4b)。Terracoccus和Arthrobacter均属于Actinomycetales，Flavisolibacter属于Chitinophagaceae，它们在土壤中均具有溶磷作用，其相对丰度随磷肥施用而升高^[27-28]。由上述结果可以看出长期施用磷肥导致砂姜黑土中溶磷细菌的相对丰度升高。我们之前的研究表明砂姜黑土对磷素具有较强的固持作用，施用磷肥后土壤中的磷主要向生物有效性低的Al-P和Fe-P转化^[4]。因此施磷土壤中大量难利用的P素可能会促进溶磷细菌的生长，而溶磷细菌可通过分泌有机和无机酸性物质、H⁺、磷酸酶、激素等提高磷素有效性^[29]。

长期施用磷肥还导致部分细菌相对丰度的降低。在门水平上，变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度随着磷肥的施入而有所降低(图 4a)。其中绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobia)均为寡营养型细菌，适宜在养分有效性低环境中生长^[30]; 相关性分析发现(表 2)，它们的相对丰度均与全磷含量成显著负相关(r= -0.82，P < 0.05;r= -0.63，P < 0.05)，因此施磷土壤中较高的养分含量可能会抑制其生长。与之前的研究结果不同，属富营养型的变形菌门(Proteobacteria)^[30]在施用磷肥后相对丰度降低; 相关性分析发现变形菌门(Proteobacteria)与pH成显著负相关(r= -0.73，P < 0.05)，这与之前的研究结果相同^[31]。因此未施磷肥土壤中较低的pH可能更适宜变形菌门(Proteobacteria)的生长(尽管不同处理间的pH差异没有达到显著水平)。在属水平上，Kaistobacter、DA101和Rhodanobacter相对丰度在施磷后有所降低(图 4b)。Kaistobacter和Rhodanobacter均为土壤中重要的反硝化细菌，可将硝酸盐转化为亚硝酸盐^[32-33]。在本研究中，其相对丰度与NO₃^--N含量均呈极显著正相关关系(r=0.93，P < 0.01;r=0.85，P < 0.01)，由此可以推断，P0处理中较高的硝酸盐含量可能更适宜其生长。DA101属于Chthoniobacteraceae，其在土壤中功能尚不清楚。P2处理中Bradyrhizobium和Burkholderia显著低于其他两个处理，Bradyrhizobium属于根瘤菌目，它和Burkholderia均是土壤中重要的固氮细菌，可将大气中的N₂固定转化为土壤氮源。P2处理中由于磷肥的不断施入，N︰P不断降低，N的有效性下降，而固氮细菌固氮作用需要大量土壤N，这种N有效性的不足可能会降低固氮菌相对丰度^[32-33]。

由以上结果可以看出长期施用磷肥可显著提高土壤中溶磷细菌相对丰度，但由于DOC、TP、NO₃^--N和pH等土壤理化指标的变化导致土壤中寡营养型细菌、反硝化细菌和固氮细菌相对丰度的降低。

以往的大量研究表明，pH是土壤细菌群落最佳预测因子，对细菌群落的变化起主导作用^[34]。朱敏^[5]和孙瑞波^[22]等分别采用荧光实时定量PCR和高通量测序技术研究不同施肥模式对砂姜黑土微生物群落的影响，其研究结果一致认为不同施肥处理后pH的变化是导致细菌群落变异的主要因素。而本研究中，DOC和TP是细菌群落最重要的决定因素(图 5a和图 5b)。这可能是由于在本研究中不同施磷处理间pH差异很小(5.22~5.53)，如此小的pH差异对细菌群落结构的改变作用并不明显。DOC是土壤中微生物可直接利用的有机碳源，而碳的有效性是限制土壤微生物生长最重要因素^[35]。Huang等^[10]研究认为施用磷肥后细菌生物量的增加主要是由于DOC含量的升高。本研究中相关性分析(表 2)表明，C︰P和N︰P与多个差异细菌间存在显著相关关系。在施磷土壤中，TP和AP含量增加，C︰P和N︰P降低，此时C源和N源成为限制微生物生长的环境因子。相反，在P0处理中，由于长期P素损耗，微生物的生长面临严重的P素胁迫，此时P取代C和N成为微生物生长的限制因子。因此不同施磷处理中这种C、N、P有效性的变化可能是导致微生物群落组成差异的重要因素。

砂姜黑土区长期施用磷肥不仅改变了微生物群落组成，同时还提高了土壤微生物功能。本研究以β-葡糖苷酶、蛋白酶、酸性磷酸酶和脱氢酶等4种胞外酶活性代表微生物功能。其中β-葡糖苷酶属于纤维素酶类，具有分解纤维素的功能，其与土壤有机质的转化关系密切。蛋白酶参与土壤中氨基酸、蛋白质的转化，其水解产物是作物生长的重要氮源。酸性磷酸酶在土壤磷素循环中具有重要作用，其活性高低可直接影响土壤磷素有效性。脱氢酶可反映土壤体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，可以作为土壤微生物降解性能的指标^[15-16]。本研究结果(图 3)表明β-葡糖苷酶、蛋白酶和脱氢酶等三种酶活性均随磷肥施入量的增加而显著升高(P < 0.05)，有趣的是酸性磷酸酶活性并未受磷肥施用的影响(P > 0.05)。这可能是由于施用磷肥后C︰P和N︰P降低，此时C和N的有效性不足，刺激微生物分泌β-葡糖苷酶、蛋白酶等与C和N循环相关胞外酶; 而施磷后土壤中磷有效性较高，微生物不需要分泌过多的酸性磷酸酶即可满足其生长对磷需求^[36]。相关性分析(表 3)表明，施用磷肥后相对丰度升高细菌与土壤酶活性之间存在显著正相关关系，其中拟杆菌门(Bacteroidetes)和Flavisolibacter与所测四种酶均成显著正相关关系。这表明长期不同磷肥施用梯度导致的微生物群落结构变化推动了土壤中与C、N、P循环转化有关的功能微生物的改变。由此可以说明土壤养分、功能微生物和土壤酶活性之间关系密切，土壤养分差异导致功能微生物的改变，从而引起土壤中酶活性的变化，而这种变化反过来又可能影响土壤性质。

长期施用磷肥可明显改善砂姜黑土土壤肥力，SOC、DOC、TP、AP以及NH₄⁺-N含量在施磷处理中显著升高。土壤肥力的提升导致细菌群落多样性显著升高，同时细菌群落结构和组成发生明显改变，而DOC和TP是影响砂姜黑土细菌群落结构的最重要的环境因子。土壤中具有溶磷作用的细菌相对丰度在施磷处理中显著升高，但寡营养型细菌、具有反硝化和固氮作用的细菌相对丰度则在施磷处理中显著降低。随着磷肥施用量的增加，土壤中酶活性也随之升高，而这种变化与土壤养分、细菌群落密切相关。