2019, Vol. 56
华北平原是我国主要的粮食产区之一，实行冬小麦/夏玉米两季轮作模式。为了提高作物产量，该地区氮肥施用量大，大量施肥在提高作物产量的同时，也会引起一系列的问题，如造成氮肥利用率低、土壤酸化、氮素损失和环境污染等[1-2]。硝态氮淋溶是华北平原主要的氮素流失途径之一，该地区主要的土壤类型为石灰性潮土，该土壤具有较强的硝化作用[3]。此外，该区域作物产量高，秸秆作为粮食生产的副产品随作物产量增加而增加，其量占全国秸秆总量的26.4%[4]，该地区秸秆利用的问题尤为突出，秸秆量过大难以有效利用，秸秆直接还田是最普遍的农业措施。在科学研究上，秸秆直接还田的利弊一直广受争议，不利因素如腐解缓慢、养分周转时间长、影响出苗、易爆发病虫害[5]及导致土壤有机酸积累等问题[5]，而生物质炭作为土壤改良剂对土壤理化性质改善、降低酸度、肥力提升和促进作物增产[6-9]等方面被众多研究者认同。秸秆炭化还田作为一种新的还田模式在促进土壤碳氮元素及速效养分的累积[10]、有效调节土壤酸碱度[8]和提高阳离子交换量[11]等方面有显著的效果。
硝化作用是在微生物作用下将铵态氮转化成移动性较强的硝态氮的过程，是氮转化过程中一个备受关注的环节，氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea，AOA)和氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria，AOB)被认为是土壤中硝化作用的主要驱动者[12]。目前有大量添加生物质炭对不同类型土壤AOA和AOB群落结构变化的研究报道，以培养试验居多，研究表明不同类型生物质炭及不同量的添加能影响硝化微生物结构，并能不同程度地刺激土壤硝化作用[13-15]; 也有研究认为生物质炭抑制轻壤土的硝化作用，不同质地土壤表现出不同的使用效果[16]。综上，添加生物炭对土壤理化性质硝化作用有显著影响，但直接还田、炭化还田及混合还田对潮土硝化作用的影响程度尚不明确，研究不同还田方式的效应差异及土壤微环境的变化，探讨理化性质变异、硝化功能与相应微生物群落之间的关系，有助于深入理解炭化还田土壤生态系统氮素循环过程。本研究在施氮量较高的华北平原典型潮土上，分析不同还田模式对土壤理化性质、硝化作用及氨氧化微生物群落变化的影响，于大田条件下进行了连续3 a的田间定位试验，以期为华北地区秸秆资源化利用提供新的途径和理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验地概况试验设置在河南省中牟县三官庙乡姬庄村进行。该区地处黄河流域，季风气候，四季分明。平均气温16.7℃。无霜期年平均233 d，年均降水量676.1 mm，最大降水量1 083 mm，6-9月份降水量占全年降水量的63%。种植模式采用华北典型的冬小麦/夏玉米一年两熟制。土壤类型为砂质潮土，其基本理化性质为：有机碳(SOC)10.10 g·kg-1，碱解氮32.62 mg·kg-1，有效磷9.3 mg·kg-1，速效钾45.0 mg·kg-1，pH为7.2;0~60 cm土壤机械组成为，砂粒783 g·kg-1，粉粒139 g·kg-1，黏粒78 g·kg-1。
1.2 试验设计试验用生物质炭购自商丘三利生物能源有限公司，原料为玉米秸秆，经厌氧450℃炭化而成。其基本性质为：总碳530.5 g·kg-1，C/N为58.0，pH为8.3。小麦品种为周麦17、玉米品种为郑单958。
2014年10月玉米收获后进行整地划分小区。试验设置①无秸秆还田(CK)，②全量秸秆还田(S)，③全量玉米秸秆炭化为生物质炭还田(B); ④半量秸秆半量生物质炭还田(SB)(一半秸秆炭化为生物质炭还田)，共4种不同物料还田方式。每处理设置3个重复，随机区组排列，小区面积为6 m×3 m= 18 m2。为阻断水分和养分的移动，小区间用3 mm厚的塑料板隔开，隔板深度为60 cm。试验开展后，在每年玉米收获后小麦播种前，连续实施上述4种还田处理，所用生物质炭为玉米秸秆定制生物质炭，根据得炭率折算每个小区需要的生物质炭量。各小区耕作方式均为旋耕15 cm深，化肥施用量一致，均为每季纯N 220 kg·hm-2、P2O5 120 kg·hm-2、K2O 60 kg·hm-2，磷钾肥在作物播种时一次性底施，氮肥60%作基肥，40%作追肥，分别在小麦拔节期和玉米大喇叭口期追肥沟施。其他农田栽培管理措施与当地农民管理习惯一致。
采样时间分别为2017年6月和2017年9月，即小麦、玉米收获前1周。采用“S”形取样法采集试验点0~15 cm土层土壤样品，每个小区采集10钻作为待测样品，然后用无菌袋密封保存带回实验室做后期的处理分析。用于微生物分析的土壤样品带回实验室后冻干、-20℃保藏。
1.3 土壤理化指标与硝化潜势测定土壤含水量采用烘干法测定; 土壤pH采用pH计(Delta 320，Mettler-Toledo，上海)测定，水土比为2.5︰1。土壤有机质、全氮、有效磷和速效钾测定参照《土壤农化分析》[17]; 土壤铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)用2 mol·L-1KCl浸提后，用连续流动分析仪(SAN++，Skalar，荷兰)测定其浓度。
土壤硝化潜势(Potential nitrification rate，PNR)的测定采用氯酸盐抑制法[18]，主要步骤：称取5.0 g新鲜土壤样品置于50 mL的离心管中，加入20 mL磷酸盐缓冲液(8.0 g·L-1NaCl，0.2 g·L-1KCl，0.2 g·L-1Na2HPO4，0.2 g·L-1 NaH2PO4)，并添加1 mmol·L-1(NH4)2SO4和10 mg·mL-1的KClO3。将离心管置于室温(25℃)下，180 r·min-1振荡培养24 h。培养结束后，加入5 mL浓度为2 mol·L-1的KCl溶液提取NO2--N，其浓度以对氨基苯磺酸和α-萘胺显色，然后在酶标仪(Thermo Scientific Multiskan，GO，Thermo Fisher Scientific，美国)上545 nm波长下比色。
1.4 土壤微生物总DNA的提取土壤微生物总DNA采用MoBio PowerSoil Isolation Kit(MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，美国)的试剂盒提取，操作步骤按试剂盒上的说明进行。用分光光度计(Nanodrop ND-2000c UV-Vis，NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，美国)检测浓度和纯度后于-20℃保存待用，使用时DNA稀释至10 ng·μL-1用于后续PCR扩增。
1.5 AOA和AOB amoA基因扩增所用引物分别为Arch-amoAF/Arch-amoAR[19]和amoA1F/amoA2R[20]扩增AOA和AOB amoA基因。PCR反应体系为25 μL，包含12.5 μL Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)，10 μmol·L-1正反向引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，其余用双蒸水补至25 μL。每个样品3次重复，反应条件依据参考文献[21]进行。获取的PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测片段大小和单一性，冷冻避光保存用于后续分析。
1.6 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和克隆文库分析同等PCR条件下，正向引物均用标记物6-荧光素(6-FAM)标记的PCR扩增产物经纯化回收后进行酶切。酶切体系为10 μL，包括大约200 ng PCR产物、5 U的限制性内切酶、0.1 μL牛血清蛋白和1 μL 10×反应缓冲液(NEBuffer)。AOA选用的内切酶是HpyCH4V，AOB选用的内切酶是RsaI。酶切及分析方法参考文献[22]进行：在37℃条件下保持3 h，95℃内切酶失活，酶切产物片段在ABI3730xl DNA analyzer(Applied Biosystems，Foster City，加拿大)上进行测定。末端限制性片段(T-RFs)相对的丰度使用GeneMarkerV2.2(ABI，美国)软件进行分析，分析电泳图谱中各峰的片段长度和峰面积。每个样品中低于最高峰值2%的峰从后续分析中剔除，片段长度差异小于等于1 bp的两个峰作为一个峰进行分析。依据图谱中T-RFs的数目及其相对丰度进行香农多样性指数(Shannon指数)的计算。
根据末端限制性片段多样性结果，筛选T-RFs多样性丰富度最高的3个DNA样品构建AOA和AOB amoA基因克隆文库，不带荧光标记的引物扩增的PCR产物经过切胶纯化后，连接到pGEM-T Easy载体上(Promega，Madison，WI，美国)，然后将载体转化入Escherichia coli JM109活化细胞中。每个样品文库分别随机挑选50个白色克隆子，共150个白色克隆子，送测序公司测序。所获目的基因序列利用QIIME软件进行序列分析，按照97%同源划分可操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)，分别获得19个AOA和16个AOB特异性序列，然后将每个OTU的代表序列用序列检索工具(BLAST)进行相似序列搜索比对，最后选择代表性序列应用MEGA 7.0软件邻接法(Neighbor-joining)构建AOA和AOB系统发育树。本研究中获取的代表性AOA-amoA 和AOB- amoA基因已提交至美国国家生物技术信息中心(NCBI)，其序列号分别为MK732036-MK732051和MK732052-MK732066。
1.7 数据分析所得试验数据采用Excel 2007软件进行制表、绘图，不同处理之间土壤基本性质、硝化潜势和amoA基因T-RFs的差异显著性用单因素方差分析进行计算。所有统计分析使用SPSS 19.0软件(IBM Co，Armonk，NY，美国)实现。采用皮尔森(Pearson)相关分析土壤理化因子、硝化微生物多样性指数和硝化潜势之间的相关关系。P < 0.05被认为具有显著性差异。使用R语言中的vegan数据包对土壤理化性质和基于不同T-RFs相对丰度的硝化微生物群落结构的关系进行冗余分析(Redundancy analysis，RDA)。
2 结果 2.1 秸秆还田方式对土壤基础理化性质的影响由表 1可知，连续进行3 a秸秆和秸秆生物质炭还田后，B和SB处理土壤pH较高，分别为7.25和7.20，但二者差异不显著，与S处理相比，仅B处理显著增加(P < 0.05);在小麦和玉米两季，与S相比，B和SB处理土壤全氮、NH4+-N和NO3--N的含量均未显著增加或降低，但与CK相比各处理显著增加(P < 0.05)。与S相比，B处理显著提高了土壤SOC含量(P < 0.05)，在小麦和玉米两个季节分别增加了19.6%和16.7%，而SB提高并不显著; B处理还显著提高了玉米季土壤水分含量(P < 0.05)，但小麦季土壤水分含量无显著提高。
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表 1 秸秆不同还田方式下小麦玉米两季潮土理化因子 Table 1 Soil properties under different straw and biochar application treatments in wheat and maize season |
与常规秸秆还田相比，B处理显著提高了两季土壤速效钾含量、降低了小麦季土壤容重(P < 0.05)，而SB与S差异不显著。
2.2 秸秆还田方式对土壤硝化潜势的影响不同秸秆还田方式显著影响了土壤硝化潜势(图 1)。小麦季，PNR的大小顺序为：B > SB > S > CK，B和SB处理分别为0.58和0.49 μg·h-1·g-1(以NO2-计，下同)，显著高于CK处理(P < 0.05);虽然秸秆还田也增加了PNR，但是与CK相比未达到差异显著水平，这表明生物炭替代秸秆还田显著增加砂质潮土硝化潜势。玉米季PNR整体低于小麦季，但是各处理PNR与小麦季规律一致，最高值为B处理，为0.27 μg·h-1·g-1干土。
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图 1 不同处理小麦和玉米生长季土壤硝化潜势(PNR) Fig. 1 Soil potential nitrification rate(PNR)during the wheat and maize seasons relative to treatment |
对小麦和玉米两季的AOA和AOB amoA基因片段进行T-RFLP分析(图 2)，获得AOA的T-RFs片段长度10个，主要的T-RFs依次为204 bp、365 bp、76 bp、258 bp和250 bp，在各个处理中均能检测到，各处理组成比例存在差异，其中优势片段204 bp占总片段的34.2%~49.6%;玉米季SB处理的比例显著降低，而片段258 bp的占比在玉米季节较小麦季均显著增加。共获得8个AOB的T-RFs片段长度，其中269 bp、255 bp、251 bp为主要片段，分别占总片段的18.5%~35.8%，15.8%~31.7%，18.0%~ 37.9%;玉米季各处理间的变化较小麦季明显，其中优势片段251 bp在CK、S、B和SB处理占比为27.1%、37.9%、20.2%和24.3%。
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图 2 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析不同处理小麦玉米两季氨氧化细菌(AOB)和古菌(AOA)的群落结构 Fig. 2 Relative abundance of Terminal-restriction fragments(T-RFs)of ammonia-oxidizing archaea(AOA)and ammonia-oxidizing bacteria(AOB)amoA gene during the wheat and maize seasons relative to treatment |
利用RDA方法分别分析不同作物生长季节土壤理化因子对硝化微生物群落组成的影响(图 3)可知，AOA的群落结构在小麦和玉米两个季节有较为明显的区分(图 3a)，空心符号代表的玉米季样本和实心符号代表的小麦季样本左右明显分开，小麦季秸秆炭化还田处理B和SB的样本倾向聚类在一起。AOB的RDA分析可以看出(图 3b)，小麦、玉米两季节的样本混合在一起，无明显的季节区分; 施用生物炭处理B和SB处理群落聚在一起，表现极大的群落结构相似性。
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注：不同颜色的点表示不同处理的土壤AOA(a))和AOB(b))群落结构特性(实心图表示小麦季土壤样品，空心图表示玉米季土壤样品)Note：Dots different in color represents AOA and AOB communities from different soil samples(solid and vacant dots represent soil samples collected during the wheat and maize seasons，respectively) 图 3 土壤理化因子与硝化微生物群落多样性的冗余分析(RDA) Fig. 3 Redundancy analysis(RDA)of soil physio-chemical properties and microbial community of nitrifying microbes in the soil during the wheat and maize seasons relative to treatment |
土壤因子pH、SOC和速效K(AK)依次分别显著影响AOA的群落结构，第一排序轴(Axis 1)解释了样本中51.5%的变异，第二排序轴(Axis 2)解释了样本24.9%的变异，两者合并解释了样本76.4%的总变异。速效K(AK)、pH、SOC和土壤容重(BD)显著影响AOB的群落结构，第一排序轴(Axis 1)解释了样本中55.2%的变异，第二排序轴(Axis 2)解释了样本20.3%的变异，两者合并解释了样本75.5%的总变异。
2.5 AOA和AOB基因序列的系统发育树克隆文库序列经筛选和序列比对，获得15个AOA的基因操作分类单元，系统发育树结果(图 4)表明，AOA amoA基因序列大部分聚类在Group1.1b(Nitrososphaera)类群中，优势片段204 bp、76 bp和258 bp均属于该类群; 片段76 bp属于Group1.1a associated，在大部分处理中占比20%以下。获得8个AOB的基因操作分类单元，系统发育树结果表明，AOB amoA基因序列聚类在Nitrosospira属的Cluster 3a，优势片段269 bp和255 bp聚类在Cluster 3a.2，优势片段251 bp和211 bp聚类在Cluster 3a.1，还有少量片段聚类在Cluster 4和Cluster 1。
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图 4 邻接法构建AOB(a))和AOA(b))amoA基因系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic trees, build with the neighbor-joining method, of archaeal amoA sequences(a))and bacterial amoA sequences(b)) retrieved from the soil relative to treatments |
相关性分析表明(表 2)，小麦季SOC、AK与PNR呈显著正相关关系，而NH4+和土壤容重(BD)与PNR呈显著负相关，这4个指标变化显著影响了硝化作用，而在该季节，AOB群落香农指数与理化因子、硝化作用之间均无显著相关，AOA群落香农指数与SOC显著负相关，AOA、AOB群落结构与PNR之间均无显著相关。在玉米季，理化因子SOC与PNR显著相关，而pH与AOA群落香农指数呈显著正相关，SOC与AOB群落呈显著正相关，该季节PNR与AOB群落香农指数极显著正相关，与AOA无显著相关关系。
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表 2 不同还田处理土壤理化性质、硝化微生物群落与硝化潜势(PNR)的相关系数(n=12) Table 2 Correlation coefficient of potential nitrification rate(PNR)with of soil properties and nitrifier community relative to season and treatment |
与秸秆相比，生物质炭有较稳定的物理化学结构，其对土壤理化因子的影响因土壤类型、生物质炭数量和种类而不尽一致。无论是短期的室内培养试验还是大田试验，均有研究结果表明施用生物质炭能显著提高土壤的有机质含量[7, 16]，而本研究试验潮土质地较轻，有机质含量低，秸秆炭化还田能有效增加有机质积累(表 1)。秸秆直接还田导致土壤酸化加剧，添加生物质炭缓解酸性土壤酸化，调节土壤的缓冲能力[23]，本研究结果也证明了生物质炭替代秸秆还田当季能有效增加土壤pH(表 1)，克服秸秆直接还田的不利影响; 相比于秸秆还田，秸秆炭化高温杀灭病虫害，生物质炭替代还田还可能会降低下茬作物病虫害的发生[5]。因本研究生物质炭用量较小，按照玉米秸秆全量还田的生物质炭替代量，每年小麦播种季施入量折合仅2.0 t·hm-2的生物质炭，在生物质炭施入的当季显著增加了pH，在玉米季pH与对照无显著差异(表 1)，可能是还田的生物质炭随着时间受土壤缓冲作用的影响所致，说明全量秸秆转化成生物质炭还田并不会导致试验潮土pH强烈增加的风险。
田间条件下，前人研究所用生物质炭量一般较高，从几吨到数十吨不等[13, 16, 24]，且多为一次施入，而本研究采用等量的玉米秸秆炭化还田，每年小麦播种季施入一次，用量相对较低，经过三年的连续试验，生物质炭替代秸秆还田较常规秸秆还田显著提高了土壤的有机碳含量，而半量秸秆炭化还田与常规秸秆还田之间无显著差异(表 1)，这与本研究所有生物质炭量相对较低有关。本研究秸秆炭化还田与常规秸秆还田相比，并未显著增加土壤的TN、NH4+-N和NO3--N含量(表 1)，与一些生物质炭添加试验研究结果一致[15, 24-25]。有些施生物质炭的研究表明，在配合不同施肥条件下增施生物质炭提高了土壤全氮的含量[16, 26]。有田间试验表明，施用生物质炭能显著提高土壤的保水性[16, 24, 27]。本研究中，全量秸秆炭化还田显著提高了玉米季土壤水分，但并未显著提高小麦季水分含量(表 1)，这可能与试验地所在区域小麦生育期水分亏缺有关，该区域冬春少雨，土壤质地轻，水分容量小，玉米生育期夏季雨水多，土壤含水量相比较高，生物质炭在土壤水分含量较高的情况下增加了水分的吸持。本研究还测定了有效磷和速效钾含量，因有效磷在4个处理间无显著差异，其数据并未列出，而秸秆炭化还田显著提高了土壤速效钾含量(表 1)。施生物质炭能提高土壤速效钾量[28]，秸秆炭化还田增产的关键因素之一为AK含量的增加[10]，在等秸秆量和等氮磷钾养分条件下，秸秆炭化还田对提高土壤盐基离子含量、有效阳离子交换量的效果明显优于秸秆直接还田[11]，本研究中小麦季AK和PNR显著相关(表 2)，这与供试潮土沙粒含量高、质地轻、肥力低、相对缺钾有关，秸秆炭化还田通过提高AK含量，增强微生物的硝化活性。
3.2 秸秆直接还田与炭化还田对潮土硝化作用的影响添加生物质炭影响土壤硝化作用，较高量的生物质炭添加刺激土壤硝化作用的增加[13, 29]。Abujabhah等[16]研究认为，添加中量生物质炭(10 t·hm-2)显著增加轻质土壤硝化作用，并影响微生物群落结构和功能。生物质炭疏松多孔，有效降低土壤容重，土壤的透气性增加，硝化微生物活性增强，进而提高硝化活性[30]。与前人研究结果一致，本研究发现，在玉米季，与常规秸秆还田相比，秸秆炭化还田显著增加了土壤硝化作用，但半量秸秆炭化处理与常规处理无显著差异(图 1)。生物质炭还田影响土壤容重，增加通气性和SOC含量，SOC与PNR呈极显著正相关，与小麦季的AOA和玉米季的AOB群落结构呈显著相关关系(表 2)。Muema等[31]研究表明，SOC对硝化微生物群落结构起决定性作用。潮土是华北平原的主要农田土壤类型，在该类型农田土壤上的研究一致认为，AOB主导氨的氧化[32]。与前人结果相似，本研究中玉米季AOB群落结构与PNR显著正相关，小麦季也有较高的相关系数，但未达到差异显著水平; 两个季节AOA群落结构与PNR均无显著相关性(表 2)。
3.3 土壤环境因子对AOA和AOB群落结构的影响AOA和AOB群落结构与土壤理化因子的RDA分析表明，pH、SOC和速效K显著影响AOA和AOB的群落结构(图 3)，AOA群落结构小麦季和玉米季分开，显著受到季节的影响，且玉米季PNR整体低于小麦季也证明由微生物介导的硝化活性受季节影响。华北小麦/玉米轮作区多为季风气候，小麦和玉米生长季节土壤养分及环境条件有较大差异，如玉米季土壤含水量高，生物质炭缓冲作用或根际分泌物的影响等导致的土壤pH较低，温度较高等因素的变化是AOA群落结构季节分异的原因; 全量和半量秸秆炭化还田处理与常规秸秆还田、不还田CK相比，氨氧化微生物相似度较高，说明秸秆炭化还田影响了硝化微生物群落结构。系统发育显示，大部分AOA基因序列聚类于土壤古菌Group1.1b(Nitrososphaera)，AOB多聚类于Nitrosospira Cluster 3(亚硝化螺菌，簇3)(图 3)，前人研究证明中性和碱性土壤中古菌组成以Group1.1b类群为主，而AOB组成以Nitrosospira Cluster 3占优势地位[33]。Group1.1a associated AOA主要分布于酸性土壤，本研究中性、偏碱性潮土中检测到该嗜酸性古菌类群的存在，表明其对中性土壤有一定的适应性，前人[12]在河南封丘不同施肥潮土中也检测到该类群AOA的少量存在。综合分析，秸秆炭化还田通过提高土壤SOC、增加pH、降低土壤容重和增加速效K的含量，增强硝化作用，并影响硝化微生物群落结构。
潮土本身硝化作用强，施氮量大，推广秸秆炭化还田会增强硝化作用，这可能意味着会加剧硝态氮的淋洗损失。有研究者通过在石灰性褐土上的一季试验表明，秸秆直接和炭化还田相比，直接还田更能增加土壤微生物对肥料氮的固持，减少氮素损失[34]。因此在华北偏碱性的潮土上，需要进一步开展长期秸秆炭化还田对硝态氮淋洗风险的研究。此外，需注意本研究中硝化微生物群落结构的认识主要基于少量土壤样品DNA的提取，且生物质炭添加引起土壤性质的变化可能对DNA提取质量及后续PCR扩增的影响并未考虑，因此在后续的研究中，可改进DNA提取方式及增加其他微生物研究手段，在继续大田定位试验的基础上，深入开展秸秆炭化还田对土壤微生物生态的认识。
4 结论与直接秸秆还田相比，炭化还田明显提高了试验潮土的SOC含量、pH和速效钾含量，降低了土壤容重，提高了试验潮土的硝化活性、并影响了硝化微生物群落组成，显著变化的土壤理化因子很大程度解释了土壤氨氧化细菌和古菌群落变化。
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