2020, Vol. 57
土壤团聚体是土壤结构的基本单元，对调节土壤的物理、化学和生物过程起着重要作用，是土壤肥力的基础。土壤团聚体内部存在十分复杂的孔隙系统，这种复杂的孔隙系统及其空间分布决定了土壤团聚体的主要功能，以及发生在团聚体内部的各种物理、化学和生物学过程，并对土壤的各种功能起着调控作用[1-3]。通过对团聚体内部孔隙系统的研究，可以了解土壤团聚体的肥力作用和调控水、肥、气、热的原理，理解土壤团聚体的各种过程和功能。团聚体内部孔隙的空间变异是其物理固碳的主要机制，土壤团聚体内部微环境的高度变异性，阻止了有机碳分解微生物的进入和酶对土壤有机碳的分解作用[1，4-5]。研究表明[6-7]，团聚体内从中心向边缘的孔隙大小分布是控制土壤团聚体稳定性和力学性质的主要机制。因此，对土壤团聚体内部微结构和孔隙的研究对深入理解土壤各种物理、化学和生物学性质具有重要的理论意义，也是了解许多土壤过程和机制的钥匙。然而，目前大多数研究均是基于对土壤团聚体宏观特征的研究，采用的研究方法基本均破坏了团聚体的结构，无法反映团聚体内部的“真实”孔隙特性和复杂的空间变化规律，需要发展原位非扰动状态进行表征的方法。
显微CT技术广泛用于研究不同材料（土壤、骨胳、陶瓷、水泥等）的孔隙结构[3，8-10]，它可以原位无损直观地描述孔隙度、孔隙大小分布、连通性和形态等孔隙特性。近年，较普通显微CT光源稳定、能量高、成像效果好的同步辐射显微CT（SR-mCT）得到应用[4，9-12]。同步辐射显微CT技术可无损地获取土壤团聚体连续切面图像以及完整的三维（3D）结构，定量计算不同类型及大小团聚体内部的孔隙数量、孔隙度和3D分布模式等。目前，已应用SR-mCT研究耕作、土地利用方式和施肥等对团聚体内部孔隙特性的影响[13-19]。如Peth等[15]采用同步辐射显微CT技术研究传统农田和草地的土壤结构，系统分析了孔隙参数（如孔隙度、孔径分布、孔隙长度、孔隙形状等），发现二者的团聚体孔隙结构存在显著性差异。周虎等[16，20]利用同步辐射显微CT技术研究了红壤恢复过程和水稻土不同利用年限的团聚体微结构演变规律。尽管随着CT技术的发展，对团聚体内孔隙特性已有初步了解，但对于团聚体内部孔隙的形态以及空间分布与定量方面存在着一系列挑战。本研究以红壤为材料，采用同步辐射X射线显微CT技术对团聚体内部结构进行连续扫描，获取高分辨率土壤团聚体三维结构图像，应用数字图像处理方法定量分析团聚体微结构特征，包括孔隙数量、孔隙度、几何形状及连通性、三维结构以及空间分布，试图解释团聚体孔隙特征与团聚体结构稳定性的内在联系，建立原位无损地研究团聚体内部结构的新方法，利用团聚体内孔隙结构来理解土壤肥力实质和各种土壤过程机理。
1 材料与方法 1.1 供试材料土壤样品采自浙江衢州第四纪红土发育的低丘红壤（网纹黏化湿润富铁土），以两个代表性土壤（标记为Q4和Q12）为材料。土地利用方式Q4为裸地，Q12为园地（柑橘）。每个土壤由5个采样点混合而成。土壤样品风干后，一部分原状土用于团聚体分析，另一部分过100目筛供土壤基本性质测定。土壤样品的基本理化性质见表 1。由表可知，两个土壤样品的平均黏粒含量、有机质和游离铁含量无显著差异，表明土壤团聚体的主要胶结物质含量基本相同。土壤全土的水稳性团聚体含量、平均重量直径（MWD）、几何平均直径（GMD）等团聚体稳定性指标存在明显差异，Q4的平均重量直径（MWD）和几何平均直径（GMD）分别为0.55 mm和0.69 mm；Q12分别为1.03 mm和0.78 mm。团聚体抗压强度（TS）Q12明显大于Q4。土壤总孔隙度Q4明显大于Q12。通过干筛法筛选出3~5 mm团聚体，在光学显微镜下挑选形状规则、近球形的团聚体样品多颗以备用。
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表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Basic proprieties of two studied soil samples |
干筛法分离出直径3~5 mm团聚体，土壤团聚体的显微CT扫描在上海光源BL13W光束线站进行。将团聚体置于塑料管内并固定在样品台上，样品与探测器距离为10 cm。样品台在水平方向从0°至180°匀速旋转，以0.25°步长进行扫描。在26 KeV能量下，使用分辨率为3.7 μm的CCD探测器采集土壤团聚体的显微CT信号，每个样品共采集720张像素为2 048×2 048的图像。由于同步辐射机时的限制，每个样品重复三次。图像重建利用上海光源CT Program软件完成，重建之后每个样品生成600张大小为2 048×2 048像素的图像，并将其存储为8位tif格式。团聚体结构的三维可视化利用ImageJ软件完成。
1.3 图像解译与处理图像亮度归一化、滤波、分割、裁剪以及土壤孔隙系统的三维可视化由软件ImageJ 1.50完成（the National Institute of Health，USA；http://rsb.info.nih.gov/ij/）。图像亮度归一化使用ImageJ软件enhance contrast模块中的亮度归一化命令完成，像素饱和率设置为0.3%，使不同CT切片的亮度差别最小化。CT扫描过程中常常存在环状伪影，会对团聚体结构分析造成一定的干扰。为了准确提取土壤孔隙结构数据，须采用图像处理方法去除环状伪影。环状伪影的去除主要步骤包括对图像进行傅里叶变换、滤波、傅里叶逆变换标等步骤。图像的降噪处理采用中值滤波法，滤波半径设置为1像素。中值滤波由ImageJ软件完成。图像二值化分割采用ImageJ软件内置的固定模式分割法，由ImageJ软件根据图像堆栈的直方图分布自动选择出分割阈值，将土壤分为孔隙和固相两相。
1.4 孔隙三维重构为了避免边缘效应，提高分析精度，本研究选取了团聚体内部400×400×400的感兴趣体元（volume of interest，VOI）进行定量分析。该体元的大小为1.48 mm × 1.48 mm × 1.48 mm。体元的选取由ImageJ软件完成。由于土壤团聚体内部的网络孔隙是高度相连的，因此在定量分析前先将孔隙提取出来。孔隙的提取由Image J软件3D插件包中的watershed split命令完成。孔隙的表面积、体积、等效直径、周长、空间坐标等参数分析由ImageJ软件的counter 3D插件包完成。孔隙的形态、各向异性和玫瑰图的生成由BoneJ插件包完成。并利用软件重构样品中孔隙的3D结构，计算样品中的孔隙大小分布。由于探测器分辨率为3.7 μm，因此将团聚体孔隙分为3.7~5、5~30、30~50、50~80、> 80 μm五个级别。
1.5 团聚体中孔隙的空间分布获取孔隙的空间分布首先需要提取所有孔隙的三维空间坐标，然后通过将所有孔隙的三维坐标投影至X-Y平面上，并将直角坐标转化为极坐标。转化方程为：
| $ R = \left( {{x^2} + {y^2}} \right)1/2, \theta = {\tan ^{ - 1}}\left( {y/x} \right) $ | (1) |
式中，R为孔隙在极坐标中的半径参数，θ为孔隙在极坐标中的方位参数。将转换后的坐标使用MATLAB软件绘制成孔隙空间分布等高图。
1.6 统计分析统计分析使用IBM SPSS22.0统计学软件包。本研究使用了单因素方差分析（one-way ANOVA）和LSD检验法用于对比一组或多组变量在P=0.05显著水平上的差异。
2 结果 2.1 土壤团聚体内孔隙形态与各向异性图 1为土壤团聚体CT扫描图以及对应感兴趣体元（VOI）经重构所得的三维结构图。2D图像表明两种土壤团聚体孔隙形貌存在较大差别，Q4团聚体中存在不同大小孔隙，且大孔隙数量较多，孔隙形状呈长条形或不规则矩形，同时能观察到圆形、长条形小孔隙。Q12团聚体内部的孔隙大部分为小孔隙，很少有中、大孔隙，且小孔隙分布较为均一。图 1C和图 1D为Q4与Q12的孔隙3D结构图，展示了团聚体孔隙3D空间分布模式。土壤团聚体的3D孔隙图像表明，两种土壤团聚体的孔隙结构、孔隙大小与分布存在明显差异。Q4孔隙含有较多大、中孔隙，且孔隙连通性较好，呈现出发育完善的孔隙结构；Q12孔隙3D图以小孔隙为主，未发现大孔隙存在，且小孔隙分布较为致密。2D和3D孔隙形貌图表明，两种土壤孔隙结构存在明显差异。Q4与Q12团聚体不同的孔隙结构特征对于团聚体结构稳定性具有明显的差异。Q4团聚体孔隙分布均匀，不同孔径孔隙均有分布，大孔隙形态各异，形成疏松结构，导致抗压强度较低；而Q12团聚体小孔隙居多，分布紧密，小孔隙的分布模式造成紧实致密的团聚体结构，与土壤抗压强度测定结果一致。
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注：三维孔隙形貌是图中由方框内区域进行重构而成。 Note:The 3-D images were reconstructed from 2-D images located in the selected square. 图 1 土壤团聚体二维（A和B）、三维（C和D）结构与孔隙各向异性（E和F） Fig. 1 Representative 2-D(A and B), 3-D images(C and D)and degree of anisotropy(E and F)of soil intra-aggregates pores by SR-mCT |
孔隙的各向异性是指孔隙在团聚体内有不同的生长方向、大小分布、排列规律和疏密程度，由此导致孔隙结构特征和功能不同。它是团聚体内不同大小、方向、形状孔隙分布排列的综合反映，可指示团聚体孔隙结构状况。图 1E和图 1F所示为两种土壤孔隙各向异性玫瑰图，图中每个棱角为孔隙生长方向的投影，不同颜色代表该方向上孔隙分布的密集程度，颜色越红表示数量越多，颜色偏蓝则相反。Q4和Q12孔隙各向异性呈现出明显的差异性，主要表现为Q4各向异性呈椭圆形，而Q12呈圆形，说明Q4团聚体孔隙生长方向、分布规律呈现出多样性，更为复杂，而Q12团聚体孔隙生长较为一致。结合图 1孔隙二维、三维结构图可以得出，Q4大孔隙发育完整，孔隙分布完善，空间排列有规律，形成了很好的孔隙性能，是团聚体结构性能突出的表现，而Q12团聚体以小孔隙为主，孔隙分布均一且排列密集，不利于良好团聚体结构的形成，因此团聚体稳定性Q12不如Q4。Q4和Q12团聚体孔隙整体呈现出较大的差异，造成团聚体结构性能的差异。
图 2所示为Q4和Q12团聚体样品中所提取的单孔隙以及多孔隙连通性示意图。Q4样品单孔隙形态各异，有圆柱体形、长条形、不规则形等形态。同样，Q12样品的孔隙形态也呈多样性。对比Q4与Q12多连通孔隙形态可知，Q4多联通孔隙连通性较好，能将多个孔隙完整连接成一条孔径，且两孔隙连通节点过渡平缓，Q12样品多连通孔隙连接处则出现较多“瓶颈”，即在连通处孔径内径骤减。同时，Q4多连通孔隙呈现出孔隙形状的多样性，各向异性较好，而Q12孔隙各向异性较差。两样品不同的单孔隙、多连接孔隙形态造成了整体孔隙性能的差异，Q4良好的孔隙连通性能有利于水分、空气、养分、热量在土壤中的传导，形成了良好的团粒结构与疏松的土质，同时有利于作物根系在土壤中的生长，共同决定着团聚体结构的发育。
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图 2 土壤团聚体单孔隙和多联通孔隙三维形貌图 Fig. 2 3-D image of single and connected pores structure intra-aggregate pores |
由于同步辐射显微CT图像分辨率为3.7 μm，因此本研究的孔隙仅针对 > 3.7 μm的孔隙。根据孔隙大小，将团聚体孔隙分为3.7~5、5~30、30~50、50~80、> 80 μm五个级别，并比较两个土壤团聚体内孔隙大小分布（PSD）的差异（图 3）。Q4的孔隙大小分布以 > 80 μm孔隙最多，约为6.5%，其次为50~80 μm，接近6%；30~50、5~30、3.7~5 μm孔隙分别为4%、2.5%、1.4%。Q12的孔隙大小分布与Q4不同，总体上以30~50、50~80、> 80 μm为主，分别为4.1%、4.5%、3.5%，其次为5~30和3.7~5 μm两级孔隙分别为1.5%和1.3%。比较分析表明，两个土壤团聚体中3.7~5 μm和30~50 μm孔隙差异不显著；而5~30、50~80和 > 80 μm孔隙Q4显著高于Q12（P < 0.05）。团聚体的孔隙度在一定程度上可反映团聚体结构性，土壤团聚体拥有较大的总孔隙度往往说明团聚体具有良好的团粒结构，稳定性也更强。在团聚体内部，> 30 μm孔隙度与 < 30 μm孔隙度间存在显著差异。土壤孔隙系统是由大小从纳米到毫米尺度的连续孔隙组成，孔隙的实际大小范围达几个量级。由于CT图像分辨率的限制，对团聚体内部的纳米尺度孔隙无法定量。土壤团聚体作为一个相对独立的封闭体系，其内部孔隙的复杂性和空间变异性，是土壤团聚体多样性功能的基础，如水分吸持、土壤固碳等。可以预计，团聚体内孔隙大小分布和空间分布的差异显著改变了团聚体内部微环境，土壤孔隙从孔隙数量（大小）和空间分布影响和控制土壤的功能，包括水、气、养分和微生物的空间分布。团聚体内孔隙的分析结果也表明土壤孔隙大小和分布对土壤管理措施和环境变化十分敏感，可用于评价土壤孔隙对长期施肥、耕作和土壤修复的响应等。
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注：误差棒代表标准误。不同的小写字母代表两个土壤之间不同大小孔隙度的显著差异（P < 0.05），大写字母代表同个土壤中不同大小孔隙的显著差异（P < 0.05）。 Note:Error bars represent standard errors. Different lowercase letters in the same pore classes indicate that the porosities are significant difference(P < 0.05)between Q4 and Q12 aggregates. Different capital letters in the same soil indicate that the porosities are significant difference(P < 0.05)among different size pores. 图 3 土壤团聚体内孔隙大小分布 Fig. 3 Pore size distribution(PSD)of intra-aggregate pores in soils |
土壤孔隙的空间变异影响土壤水分和空气的交换，团聚体内孔隙的空间变异是微生物群落和有机质保护的主要机理[1，5，15]。根据不同大小孔隙的功能，一般将 > 30 μm孔隙作为大孔隙，< 30 μm为小孔隙。利用ImageJ软件提取团聚体单位空间的孔隙坐标信息，通过投影和坐标转换，绘制孔隙空间分布等高线图。孔隙等高线图可直观清晰地反映团聚体内孔隙的分布模式。图 4为Q4和Q12团聚体 < 30 μm与 > 30 μm两级孔隙空间分布等高线图，蓝色为 < 30 μm孔隙空间分布图，红色为 > 30 μm孔隙空间分布图。图中每个黑点代表团聚体中一个孔隙，等值线的形状代表孔隙分布模式，图中颜色越浅表示孔隙密度越低，颜色越深则孔隙分布越密集。分析Q4和Q12两级孔隙分布模式可知，Q4团聚体中 > 30 μm孔隙分布总体上比较均匀，在整个团聚体面上均有分布，其中以中心部位偏高，呈中间向圆周略有减小趋势；< 30 μm孔隙主要分布在团聚体中心区域，向四周锐减，边上分布密度较低，说明上述大小的孔隙主要分布在团聚体中心。Q12团聚体 > 30 μm孔隙总体分布密集，主要分布在团聚体外围，且密度较高，而在中心分布较少，说明上述大小的孔隙主要分布在团聚体周围；Q12 < 30 μm孔隙分布与Q4相似，中间分布密度高，四周密度非常低。土壤孔性是土壤结构性的反映，不同粒径孔隙的空间分布规律决定着水、肥、气、热等介质在土壤中的传输，直接影响土壤物理-力学性质及土壤团聚体结构稳定性。综合Q4和Q12两级孔隙分布可知，整体上Q4孔隙分布较Q12更为均衡，以 > 30 μm尤为突出，孔隙空间分布的均匀性意味着孔隙性能更好，团聚体结构更为疏松，土壤耕性较好[14，15]，这与两种土壤抗压强度测定值一致（表 1）。
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注：图中每个黑点代表团聚体中一个孔隙，图中颜色深浅表示孔隙密度，颜色越深表示孔隙分布越密集，颜色越浅表示孔隙密度越低。 Note:Each black point represents a pore. The light color represents the lower pore abundance and the deep the higher. 图 4 土壤团聚体内孔隙（> 30 μm和 < 30 μm）空间分布 Fig. 4 Spatial distribution of intra-aggregate pores(> 30 μm and < 30 μm)in soils |
应用同步辐射显微CT和数字图像处理技术，分析了两种不同稳定性的红壤团聚体内部孔隙结构，包括团聚体的3D形态和孔隙的各向异性、孔隙的连通性、大小分布和空间分布。两种土壤团聚体孔隙形貌存在明显差异，Q4团聚体孔隙含有较多大孔隙，孔隙形态各异，各向异性呈椭圆形，孔隙生长方向、分布规律呈现出多样性，多联通孔隙连通性较好；Q12团聚体孔隙以小孔隙为主，分布密集，孔隙各向异性为圆形，团聚体孔隙生长较为一致，多连通孔隙连接处则出现较多“瓶颈”。SR-mCT结合图像分析建立了土壤团聚体中 > 30 μm大孔隙和 < 30 μm的空间分布模式，不同结构性能的团聚体内孔隙空间分布呈现出不同的模式。Q4团聚体 > 30 μm孔隙分布比较均匀，以中心部位偏高，呈中间向圆周略有减小趋势；Q12团聚体 > 30 μm孔隙分布密集，主要分布在团聚体外围，中心分布较少。孔隙空间分布的均匀性意味着孔隙性能更好，从团聚体孔隙空间分布模式可以很好地解释土壤团聚体结构性能差异的原因。结果表明，SR-mCT分析的团聚体孔隙结构较好地解释了土壤团聚体稳定性机理，帮助预测和模拟土壤团聚体中的各种物理过程和宏观功能。为利用团聚体内部孔隙结构来理解土壤肥力实质和各种土壤过程机理提供科学依据。
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