AM真菌共生系统中硝态氮吸收转运途径及对寄主生长的作用

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土壤学报

2020, Vol. 57

Issue (6): 1483-1491 DOI: 10.11766/trxb201909090476

引用本文

李梦瑶, 蒋湘艳, 金海如. AM真菌共生系统中硝态氮吸收转运途径及对寄主生长的作用. 土壤学报, 2020, 57(6): 1483-1491.

LI Mengyao, JIANG Xiangyan, JIN Hairu. Modes of Uptake and Translocation of NO₃^- Affecting Growth of Host Plants in Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis. Acta Pedologica Sinica, 2020, 57(6): 1483-1491.

基金项目

国家自然科学基金项目（41371291）和浙江省公益技术应用研究计划项目（LGN20D010002）资助

通讯作者Corresponding author

金海如, E-mail:hrjin@zjnu.cn

作者简介

李梦瑶（1995—），女，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事菌根真菌代谢研究。E-mail：396315349@qq.com

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AM真菌共生系统中硝态氮吸收转运途径及对寄主生长的作用

李梦瑶, 蒋湘艳, 金海如

浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004

收稿日期：2019-09-09；收到修改日期：2019-11-27；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2020-03-23

基金项目：国家自然科学基金项目（41371291）和浙江省公益技术应用研究计划项目（LGN20D010002）资助

作者简介：李梦瑶（1995—），女，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事菌根真菌代谢研究。E-mail：396315349@qq.com.

通讯作者Corresponding author：金海如, E-mail:hrjin@zjnu.cn.

摘要：利用AM真菌（Glomus intraradices）与毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根（Ri T-DNA transformed carrotroots）建立的双重培养系统，以及同位素示踪技术探究AM真菌共生系统中硝态氮NO₃^-转运吸收途径，对铵态氮和硝态氮吸收合成精氨酸进行研究；并开展农田试验研究铵态氮和硝态氮吸收转运对寄主生长的影响。研究发现AM真菌菌丝在NH₄⁺和NO₃^-共存时，优先吸收NH₄⁺。当AM真菌的根外菌丝用NH₄¹⁵NO₃处理1周时，虽然根外菌丝的自由氨基酸未被¹⁵N标记，包括精氨酸，但是菌根组织中的自由氨基酸被¹⁵N标记，揭示了¹⁵NO₃^-沿着菌丝直接转运至菌根组织而不是来自于精氨酸转运的新模式；而根外菌丝用¹⁵NH₄NO₃处理时菌根组织中只有精氨酸被¹⁵N标记，而其他氨基酸合成的氮素主要来自菌丝室运转来的¹⁴NO₃^-，所以未被标记。AM真菌根外菌丝加¹³C_6^-葡萄糖，培养6周后，发现菌根组织的精氨酸和蛋白质均未发现¹³C，说明其根外菌丝不能利用葡萄糖。菌丝室加¹³C_1.2^-乙酸钠后，菌根组织的精氨酸和蛋白质均发现¹³C，分别为8.5%±2.3%和7.6%±0.7%，说明其根外菌丝能吸收利用乙酸盐中的碳素。菌丝室加¹³C_1.2^-乙酸钠+¹⁵NO₃后，随着氮源的增加，其自由精氨酸浓度提高为54.2%±19.3%，菌根蛋白质中精氨酸浓度变化不大；同时菌根组织的精氨酸和蛋白质中C/N同位素标记丰度大大提高，分别为57.4%±4.8%和50.3%±2.8%，说明菌丝室加碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成。大田试验中，在低磷条件下，接种AM真菌并添加硝酸钾后菌根化甜玉米茎叶重明显提高，相比对照的甜玉米提高了12.28%；硫酸铵则不如硝酸钾对AM真菌菌根化甜玉米株重的促进作用，反而是降低了其生物量8.19%，尿素则降低了13.02%，但尿素再加有机肥则可以缓解对生物量的降低作用。

关键词：丛枝菌根真菌碳源氮源精氨酸 ¹⁵N标记 ¹³C标记

Modes of Uptake and Translocation of NO₃^- Affecting Growth of Host Plants in Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis

LI Mengyao, JIANG Xiangyan, JIN Hairu

College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China

Foundation item: Supported by the National Natural Science Fundation of China(No. 41371291) and the Project of Zhejiang Public Welfare Technology Application Research Plan(No.LGN20D010002)

Corresponding author: JIN Hairu, E-mail:hrjin@zjnu.cn.

Abstract: 【Objective】Effects of uptake and translocation of NO₃^- in arbuscular mycorrhizal symbiosis and formation of arginine (Arg) in extraradical mycelium (ERM) and mycorrhizal root when ERM was exposed to NO₃^- or NH₄⁺, affecting growth of their host plants were studied.【Method】In this study a dual split culture system was established with Ri T-DNA transformed carrot root and Glomus intraradices (Rhizophagus intraradices) and the ¹⁵N/¹³C isotope tracing technique was used to explore pathways of the uptake and transport of NO₃^-, and determine how much arginine accumulated in ERM and mycorrhizal root after NO₃^- or NH₄⁺ was absorbed and translocated in the fungal compartment, and a field experiment was conducted too to address how uptake and translocatiton of NO₃^- or NH₄⁺ affect growth of the host plants.【Result】Results show that AM hypha preferred to uptake NH₄⁺ over NO₃^- when they both were available in the soil. When AM extraradical hypha were exposed to NH₄¹⁵NO₃ for 1 week, though the free amino acids, include Arg, in the extraradical mycelium (ERM) were not labelled by ¹⁵N, those in the mycorrhizal tissues were, indicating that ¹⁵NO₃ in the fungal compartment were transported directly via mycelium into mycorrhizal tissues rather than any new translocation mode; on the contrary, when extraradical hypha were cultured with ¹⁵NH₄NO₃, only Arg was ¹⁵N-labelled therein, while the form of nitrogen composed of other amino acids in the ERM was ¹⁴NO₃ translocated mainly from the hypha compartment and hence not labelled. While exposed to ¹³¹³C_6^-Glucose for 6 weeks, the ERM was found to have no ¹³C-labelled Arg or protein, which indicates that ERM is unable to utilize glucose. When exposed to ¹³C_1.2^-acatate, the ERM was found to have Arg and protein ¹³C labelled up to 8.5%±2.3% and 7.6%±0.7%, respectively; when exposed to ¹³C_1.2^-acatate plus 15 NO₃^-, the ERM increased the concentration of free Arg with increasing N input, up to 54.2%±19.3% and ¹³C labelled Arg and protein up to 57.4%±4.8% and 50.3%±2.8%, respectively, which indicates that increased C and N inputs in the hypha compartment may promote formation of Arg. In the field experiment, in the field low in P level, addition of KNO₃ increased significantly weight of the AM-inoculated sweet corm plants by 12.28%, as compared to the control, but addition of NH₄SO₄ did not have such an effect and instead decreased biomass of the plants by 8.19%, and addition of urea did by 13.02%; however amendment of organic manure to urea application mitigated the adverse effect.【Conclusion】There are two different modes of AM fungi absorbing and transporting ammonium and nitrate. AM fungi absorb and transport ammonium nitrogen (NH₄⁺ and urea), via GS-GOGAT in ERM, and most of the absorbed nitrogen is integrated into Arg molecules, and the synthesized arginine is intactly transported to the intraradical mycelium by ERM. Meanwhile, NO₃^- in the AM fungi symbiosis, as revealed by the isotope tracing technique, is adsorbed by ERM and transported via ERM to intraradical mycelium. Application of NO₃ may promote growth of the AM fungi-hosted sweet corn, while application of NH₄⁺ may affect the crop reversely.

Key words: Arbuscular mycorrhizal fungi Carbon source Nitrogen source Arginine ¹⁵N labelling ¹³C labelling

同位素示踪技术及酶学和基因表达分析至今已证实AM真菌吸收氮素并转运给植物，其能利用无机态的铵态氮、硝态氮，有机态的氨基酸等^[1-5]，而且Jin等^[5-7]利用AM真菌（Glomus intraradices）与毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根（Ri T-DNA transformed carrotroots）建立的双重培养系统研究提出了AMF菌丝内氮素运转模型，即AM真菌也可以从土壤吸收多种不同来源的氮，如${\rm{NH}}_4^ + $、${\rm{NO}}_3^ - $和氨基酸，这些不同的氮源通过AM真菌根外菌丝内谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途径被吸收利用，而吸收的氮大都整合入精氨酸（Arg）分子，合成的精氨酸可以被AM真菌根外菌丝完整地运转至根内菌丝，而且可以在菌丝体内双向运转，再将被输送的精氨酸通过尿素循环（urea cycle）释放出N，以${\rm{NH}}_4^ + $形式传递给植物寄主。这为进一步研究AM真菌对氮素的吸收和传递特点提供了理论依据。

该途径的研究是以容易吸收利用的${\rm{NH}}_4^ + $作为氮源而证明精氨酸在菌丝中大量积累，但是以${\rm{NO}}_3^ - $为氮源时并未发现菌丝中有大量精氨酸的积累，故并不清楚${\rm{NO}}_3^ - $的吸收和转运过程。尽管研究表明AM真菌的ERM能吸收不同无机态氮（${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $），当两者共存时AM真菌通常先利用${\rm{NH}}_4^ + $^[1-2]，因为由硝酸盐还原酶（nitrate reductase，NR）转化${\rm{NO}}_3^ - $需要更多能量，所以相较于${\rm{NO}}_3^ - $更有效。而且根外菌丝吸收转递${\rm{NH}}_4^ + $的能力高于${\rm{NO}}_3^ - $，如Tanaka和Yano ^[8]指出根外菌丝吸收${\rm{NH}}_4^ + $向寄主植物传递的氮较${\rm{NO}}_3^ - $高10倍；相比较${\rm{NH}}_4^ + $，虽然吸收了${\rm{NO}}_3^ - $但并非均传递给植物，一部分停留在菌丝体内，所以测得的寄主植物根系¹⁵N丰度显著高于地上部。这种对硝酸盐氮吸收传递的低效性可能是因为其高流动性，但Tanaka和Yano认为可能是AM真菌在氮传递上的一种歧视性。Tanaka和Yano分析了根内菌丝利用其ERM转运的¹⁵N来合成细胞壁，但未测量根内菌丝和根外菌丝氨基酸中¹⁵N的区别，没有进一步揭示硝酸盐氮的转运过程。

关于${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $吸收分子机制，转录组研究揭示了部分在孢子、IRM、ERM中表达的真菌${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $输运蛋白，其中，GintAMT1转运蛋白的表达是底物诱导型而且受${\rm{NH}}_4^ + $供应和真菌${\rm{NH}}_4^ + $水平所调节^[9]，低浓度可诱导AM真菌的转运蛋白GintAMT1表达，而在高浓度下其表达被抑制。相比较，GintAMT2在N限制条件下在ERM组成型表达，当不同氮源加入缺氮的ERM时瞬即可以被诱导，对不同N源下代谢生成的${\rm{NH}}_4^ + $水平具有维持作用^[10]。GintAMT3在IRM中的表达受底物浓度和C供应调节，在高P情况下其表达量增加^[11]。不同转运蛋白在真菌不同部位转录水平不同说明不同转运蛋白在氮的吸收和运输中起着不同作用。ERM中GintAMT1转录水平高说明其参与真菌菌丝从土壤中获取${\rm{NH}}_4^ + $的过程，GintAMT2在IRM中特异性表达说明其在真菌从共生系统的交界面处起重吸收作用^[10]。GintAMT3在高P情况下表达量增加说明当AM真菌获取更多P的同时也转移更多的N给寄主^[11]。外界供应${\rm{NO}}_3^ - $能刺激Rhizophagus irregularis ERM中真菌${\rm{NO}}_3^ - $转运蛋白的表达，但内部${\rm{NH}}_4^ + $水平或者下游代谢物谷氨酰胺的提高会抑制这个转运蛋白的表达^[12]。在不同氮源下AM真菌${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $输运蛋白的表达特征说明氮分解代谢阻遏能够控制AM真菌从土壤中吸收N^[13]。

尽管在AM真菌对不同无机氮（${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $）的吸收特性、不同传递效果和基因表达差异有所研究，但是并未研究清楚培养介质中${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $对寄主生长的影响，尤其不清楚${\rm{NO}}_3^ - $吸收、转运途径及其转运后菌丝和菌根组织中氮的分配。研究表明外界无机氮的浓度以及植物生长各个时期对氮的需求状况会显著影响AMF菌丝吸收和转运氮素的量。邓胤等^[14]发现在高浓度的外界氮（10 mol·L^–1）或磷（1 mol·L^–1）下，接种AM真菌反而使植物生物量下降。李侠和张俊伶^[15]发现接种AM真菌（Rhizofagus G. intraradices，G. mosseae）降低寄主植物地上部含N量和干重。但是在正常的供氮（2 mol·L^–1）和磷（0.1 mol·L^–1）时，接种AM真菌显著提高玉米的生物量，这是改善P营养的结果，而对N营养影响小^[14]。此外，虽然Bago等^[16]研究了AM真菌的ERM可以吸收乙酸盐和甘油，但不吸收葡萄糖；Jiang等^[17]发现了植物传递脂类物质给共生AM生长繁殖；Fellbaum等^[13]发现碳的存在刺激了AM真菌氮素的吸收和转运；但是这些工作并未研究碳源或脂类以及外源氮对精氨酸合成的影响，因为精氨酸是AM真菌共生系统中氮素吸收和转运的载体，所以这些外源的吸收利用对氮素载体精氨酸合成和转运的影响也需要进一步研究揭示。本文将利用同位素示踪技术、AM真菌（Glomus intraradices）与毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根（Ri T-DNA transformed carrotroots）建立的双重培养系统及农田试验研究这些问题。

1 材料与方法 1.1 离体培养菌根

采用分隔培养皿方法将毛根农杆菌质粒DNA转化的胡萝卜根（Ri T-DNA trans-formed carrot roots）（Daucus carota L.）于24℃培养在含有4 g·L^–1植物胶的改进型M培养基中^[5]。菌根室的培养基依照Jin等^[5]方法改进后限制氮浓度。

1.2 对不同碳、氮源的吸收和¹³C/¹⁵N的标记

氮素吸收和¹⁵N标记实验在经改良不含葡萄糖的液体M培养基中进行^[18]。用180 mg·L^–1 CaCl₂·2H₂O代替288 mg·L ^–1Ca（NO₃）₂·4H₂O，标记的¹⁵N底物为氮素唯一来源。¹³C/¹⁵N标记的底物（98%）为：[¹⁵N，98%]KNO₃+¹³C_1，2 乙酸盐或¹³C₆-葡萄糖、[¹⁵N]KNO₃（4 mmol·L^–1）、¹⁵NH₄NO₃（4 mmol·L^–1）、NH₄¹⁵NO₃（4 mmol·L ^–1）和[¹⁵N，98%]¹⁵NH₄SO₄。标记物溶液过滤消毒后加至60 mm灭菌培养皿中培养，不加其他氮源。配好培养基后调节pH至6.0。每种氮源重复处理6个培养皿，作为3个重复。

1.3 游离氨基酸提取

培养1天、3天、1周、3周和6周后，用38 μm网状筛收集菌根和菌丝及孢子，去离子水清洗。样品冷冻干燥后加入少许酸洗过的沙用研钵研磨，用4℃ NH₄HCO₃缓冲液（pH = 8，含0.2% NaN₃）提取。提取液在40 mL NH₄HCO₃缓冲液中于4℃透析24 h，透析膜允许分子量2 000的分子透过。收集渗透液，冷冻干燥后–20℃储存。然后溶解于2 mL 0.01 mol·L^–1 HCl，装入阳离子交换柱（0.3 mL的DOWEX 50 X 8-200-阳离子型），柱先用2 mol·L^–1 NH₄OH、2 mol·L^–1 HCl和去离子水润洗，再用去离子水洗至流出液为中性。用5 mL去离子水洗下柱的中性复合物，再用2 mL 1 mol·L^–1的NH₄OH洗脱收集游离氨基酸。洗提液收集后冷冻干燥用于GC-MS和HPLC分析。孢子中游离氨基酸提取和分析时用外标法计算各种氨基酸的浓度，每个样品重复3次。

1.4 AM真菌菌根中可溶性蛋白质的酶水解

1.3中透析膜内物质离心后，上层含有可溶性蛋白质，冷冻干燥后重新悬浮在600 μL 20 mmol·L^–1的NH₄HCO₃缓冲液中（pH = 8，含0.2% NaN₃）。加入新鲜溶解蛋白酶（2 μL氨肽酶M，2 μL链霉蛋白酶E，2 μL羧肽酶Y），30℃振荡培养6 h。加入新鲜的酶继续培养6 h，4℃ 10 000 r·min^–1转下离心10 min，上层清液冷冻干燥并重新悬浮于2 mL水中，随后冷冻干燥悬浮于1 mL水中。所得可溶性蛋白氨基酸按照1.3步骤纯化，用MS进行¹⁵N的测定。

1.5 自由氨基酸的同位素分析

用GC-MS分析标记氨基酸^[5]。从组织中提取的氨基酸进行衍生化反应。先加入10~20 μL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），根据样品量加30~50 μL的N-甲基-N-特丁基二甲基硅烷-三氟乙酰胺（MTBSTFA），110℃电炉上加热30 min。

甲硅烷基化的提取物注射入Finnigan Trace MS 2000设备，0.25 μm厚的石英毛细管柱（直径0.25 mm，长30 m，RTX-5MS，Restek Inc.Flemington，NJ），此柱连接到质谱仪的四极质量检测器（Thermo Electron，Madison WI）上，He作为载气，流速1 mL·min^–1。程序升温：110℃ 2 min，10℃·min^–1升温至260℃，维持5 min。电子冲击离子化能量70 eV，检测器扫描质量范围150~600 m·z^–1，时间0.5 s，与20种标准氨基酸比较，鉴定样品中的氨基酸。除Arg外，Orn和其他氨基酸通过N-（特丁基二甲基硅）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）衍生化后测定M-57离子确定。

1.6 HPLC分析氨基酸的含量

根据Endres和Mercier^[19]的方法用Waters^TM（Milford，MA）717HPLC系统测定各种氨基酸含量。设备包括Waters510自动取样器和泵，一个Waters可调吸收检测器和Millenium数据处理软件。提取的氨基酸溶解于500 μL 0.1 mol·L^–1 HCl，Pico-Tag工作台上真空干燥，加入乙醇、水和三乙胺（体积比2︰2︰1）后真空干燥。随后加入乙醇、水、三乙胺和异硫氰酸苯酯（体积比7︰1︰1︰1）室温放置20 min，进行氨基酸衍生反应，衍生物真空干燥后备用。每个样品取20 μL注射至反相C18柱（3.9 mm内径× 150 mm长）。38 mL的Pico-Tag洗脱液A和B作为流动相；洗脱液流速为1 mL·min^–1，其中洗脱液B比例逐渐上升。检测波长254 nm。测定前所有溶液真空条件除气1 min。与已知标准氨基酸的峰值和保留时间比较，计算样品中各种氨基酸的含量。

1.7 AM真菌不同无机态氮吸收利用对寄主植物甜玉米生长的实验

在特制培养盒中加入适量灭菌的沙土。选取饱满的新鲜甜玉米种子，消毒后播种。接种AM真菌根内球囊霉（G. intraradices），每隔一周，施加改良的霍格兰德营养液50 mL补充营养，培养一段时间后移栽入大田中。继续施加改良的霍格兰德营养液，共施加5次，同时补充不同氮素（尿素、尿素+有机肥、硝酸钾、硝酸钙和硫酸铵）。氮浓度为4 mmol·L^–1的无机氮源。此外，分别施加浓度为0.15 g·L^–1（高磷）和0.05 g·L^–1（低磷）的磷酸二氢钾溶液，每次100 mL。实验玉米共生长60 d后回收分析其株重。甜玉米试验每种氮源重复处理15株。

1.8 统计分析

对重复样品分析得到的结果采用SPSS 18.0软件进行相关统计分析。

2 结果 2.1 AM真菌对不同无机态氮素的吸收特征

图 1a表明AM真菌共生系统中根外菌丝用${\rm{NH}}_4^{15}{\rm{N}}{{\rm{O}}_3}$处理1周后，根外菌丝中的自由氨基酸（除了谷氨酰胺Gln）未被¹⁵N标记，但¹⁵NH₄NO₃处理后，其氨基酸¹⁵N^–标记含量很高，说明${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $共存时，AM真菌菌丝优先吸收${\rm{NH}}_4^ + $。

图 1 AM真菌共生系统中菌丝室用¹⁵NH₄NO₃或NH₄¹⁵NO₃处理6天时其根外菌丝（a）和菌根组织（b）自由氨基酸的¹⁵N标记 Fig. 1 ¹⁵N labelling of free amino acids in extraradical mycelium(ERM)(a)and mycerrhizal tissues(b)in the hypha compartment of the AM fungi symbiosis treated with ¹⁵NH₄NO₃, NH₄¹⁵NO₃ or ¹⁵NH₄ for 6 days

但是，如图 1b，当AM真菌的根外菌丝用${\rm{NH}}_4^{15}{\rm{N}}{{\rm{O}}_3}$处理1周后，虽然根外菌丝的自由氨基酸未被¹⁵N标记，包括精氨酸，但菌根组织中的自由氨基酸被¹⁵N标记，其中精氨酸¹⁵N丰度为57%，其他氨基酸丙氨酸（Ala），亮氨酸（Leu），丝氨酸（Ser），谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）也被标记，而甘氨酸（Gly），缬氨酸（Val），苯丙氨酸（Phe），天门冬氨酸（Asp）未被标记。相比较，根外菌丝在¹⁵NH₄NO₃培养时菌根组织中仅精氨酸被¹⁵N标记的结果，其他氨基酸合成主要来自从菌丝室运转来的$^{{\rm{14}}}{\rm{NO}}_3^ - $，所以未被标记，而只有从菌丝室转运来的精氨酸被¹⁵N标记。当菌丝室只有$^{{\rm{15}}}{\rm{NH}}_4^ + $培养时，菌根组织的其他大多数氨基酸被¹⁵N标记。

2.2 AM真菌共生系统中外源碳和氮源对菌丝合成精氨酸的影响

AM真菌根外菌丝加¹³C₆-葡萄糖培养6周后，菌根组织的精氨酸和蛋白质中均未发现¹³C（表 1），说明其根外菌丝不能利用葡萄糖。而无侵染的根组织培养于¹³C₆-葡萄糖6周后，根组织中的自由精氨酸¹³C丰度为22.8%±1.8%，根蛋白质中¹³C丰度为17.7%±1.0%，表明根组织可以吸收利用葡萄糖合成精氨酸，其自由精氨酸浓度为10.9%±4.8%，菌根蛋白质中精氨酸浓度为10.2%±0.5%。菌丝室加¹³C_1，2^-乙酸钠后，菌根组织的精氨酸和蛋白质中都发现有¹³C标记，分别为8.5%±2.3%和7.6%±0.7%，说明其根外菌丝能吸收利用乙酸盐中的碳素，此时其自由精氨酸浓度为10.3%±0.3%，菌根蛋白质中精氨酸浓度为8.3%±0.8%。

表 1 外源碳和氮源对菌根组织及其蛋白质中精氨酸浓度和同位素丰度的影响 Table 1 Effect of exogenous carbon and nitrogen input on formation and ¹³C/¹⁵N labelling of Arg in mrcorrhizal tissues and protein

菌丝室加¹³C_1，2乙酸钠+¹⁵NO₃后，随着氮源的增加，其自由精氨酸浓度提高为54.2%±19.3%，菌根蛋白质中精氨酸浓度变化不大，为8.0%±0.7%；同时菌根组织的精氨酸和蛋白质中C/N同位素标记丰度大大提高，分别为57.4%±4.8%和50.3%±2.8%。说明菌丝室增加可利用碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成。

2.3 AM真菌吸收利用不同无机态氮对寄主植物甜玉米生长的影响

大田试验中（如图 2），在低磷条件下，接种AM真菌并添加硝酸钾菌根化玉米茎叶重明显提高，相对无菌根化低磷条件下的甜玉米提高了12.28%，其次硝酸钙也有提高作用，可提高2.94%；硫酸铵则不如硝酸钾对AM真菌菌根化甜玉米株重的促进作用，反而是降低了其生物量8.19%，尿素则降低了13.02%，但尿素和有机肥则缓解这种生物量抑制作用。

注：图中同一处理无相同字母表示差异显著（P < 0.05）。 Note:Different letters in the same treatment indicate significant difference at 0.05 level. 图 2 不同氮素形态在高磷和低磷下对甜玉米株重的影响 Fig. 2 Effect of form of applied nitrogen on per-plant weight of sweet corn cultured in soil high/low in P concentration

在高磷条件下，接种AM真菌并添加硝酸钾菌根化玉米穗重显著提高，相对无菌高磷提高达31.75%，其次硝酸钙提高2.43%；硫酸铵则不如硝酸钾，只有1.32%，尿素在高磷下则减少其生物量11.97%，施加尿素和有机肥则缓解抑制作用，反而提高3.52%。

3 讨论 3.1 AM真菌吸收和转运无机态氮素的模式差异

AM真菌可以吸收无机态氮素${\rm{NH}}_4^ + $和${\rm{NO}}_3^ - $，不过更易吸收前者，因为消耗更少的能量。而且在ERM中能将吸收的${\rm{NH}}_4^ + $通过菌丝内谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途径整合入精氨酸，并且迅速通过菌丝转运给根内组织，进而通过精氨酸分解酶释放出尿素和鸟氨酸，再将尿素分解为氨传递给寄主植物利用。这个途径由Jin等^[5]通过同位素示踪技术发现和证明，与Tisserant等^[20]从转录组学分析的结果一致，即氮素吸收关键途径酶如谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、精氨琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthetase）、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸分解酶、鸟氨酸氨基转移酶、鸟氨酸脱羧酶和脲酶等基因的高表达。

尽管AM真菌更易吸收${\rm{NH}}_4^ + $，但是对土壤中的${\rm{NO}}_3^ - $，不管是其孢子、ERM和IRM都能吸收，这由Jin等^[5，21]用同位素示踪已经证明，而且Tisserant等^[20]从转录组学分析也揭示了硝酸盐还原酶（Nitrate reductase）和亚硝酸盐还原酶（nitrite reductase）基因在孢子、ERM、IRM中皆有表达，其转录水平在IRM中很高。这说明硝酸盐直接在ERM中被同化的少，而是能在寄主植物根内的真菌组织IRM中被还原^[20，22]。亚硝酸盐被亚硝酸盐还原酶还原，一个编码AM真菌亚硝酸盐还原酶的基因在孢子和IRM中有较高表达水平^[20]，这与AM真菌菌根中IRM里的真菌硝酸盐还原酶的高转录水平结果一致，此时，菌根植物中植物硝酸盐还原酶转录水平比非菌根植物中的低^[22，23]，这说明植物亚硝酸盐还原酶被从真菌转移到寄主植物的还原态N所抑制^[24]。

于是，AM真菌对${\rm{NO}}_3^ - $的吸收和还原大部分是根内菌丝完成，说明部分氮可能是以${\rm{NO}}_3^ - $形式转运，验证了Johansen等^[25]早期推测氮是以${\rm{NO}}_3^ - $为主的形式在菌丝内转移。这与同位素示踪的研究结果一致，即当AM真菌的根外菌丝用NH₄¹⁵NO₃处理1周时，虽然根外菌丝的自由氨基酸未被¹⁵N标记，包括精氨酸，但是菌根组织中的自由氨基酸被¹⁵N标记，其他氨基酸丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）和谷氨酰胺（Gln）也被标记，而甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val）、苯丙氨酸（Phe）、天门冬氨酸（ASP）未被标记，这样的结果可能不是来自于精氨酸转运来的，而是来自于$^{{\rm{15}}}{\rm{NO}}_3^ - $沿着菌丝的直接转运（类似精氨酸（Arg）转运），在根内菌丝先被硝酸盐还原酶转化为${\rm{NH}}_4^ + $进而被利用合成氨基酸（也有部分${\rm{NH}}_4^ + $传递给了寄主细胞利用）；当菌丝室ERM只有$^{{\rm{15}}}{\rm{NH}}_4^ + $处理时，菌根组织的其他大多数氨基酸被¹⁵N标记，说明这些¹⁵N主要来自精氨酸转运的N；然而当ERM用¹⁵NH₄NO₃处理时，发现只有精氨酸被¹⁵N标记，其他氨基酸未被标记，其合成可能主要来自从菌丝室扩散或运转来的$^{{\rm{14}}}{\rm{NO}}_3^ - $，所以，只有从菌丝室转运来的精氨酸被¹⁵N标记而其他氨基酸则未被标记。这表明AM真菌对无机氮素存在两种不同的吸收模式，即对${\rm{NH}}_4^ + $是通过菌丝吸收整合入精氨酸，再通过菌丝转运至IRM，在IRM被分解成${\rm{NH}}_4^ + $再传递给寄主，而对于${\rm{NO}}_3^ - $则除了小部分被ERM吸收还原为${\rm{NH}}_4^ + $，大部分则是通过菌丝扩散或转运至IRM再被吸收利用，这与Hildebrandt等^[23]的结论是一致，而且Drechsler等^[26]进一步发现在水稻菌根中四个硝酸根输运蛋白基因NPF2.2/PTR2，NPF1.3，NPF6.4和NPF4.12受AM真菌诱导高表达，支持了该结论。

3.2 外源碳和氮素对AM真菌合成精氨酸的影响

精氨酸是AM真菌菌丝转运氮素的载体。在菌丝和菌根组织中的精氨酸浓度反映了其合成、转运及分解的平衡结果。Jin等^[5]用HPLC分析了AM菌丝吸收利用${\rm{NH}}_4^ + $合成精氨酸的浓度，是菌丝中自由氨基酸的主要成分。本研究发现AM真菌根外菌丝加¹³C₆-葡萄糖，培养6周后，菌根组织的精氨酸和蛋白质均未发现¹³C，说明其根外菌丝不能利用葡萄糖。菌丝室加¹³C_1，2乙酸钠后，菌根组织的精氨酸和蛋白质中均发现¹³C，说明其根外菌丝能吸收利用乙酸盐中的碳素；菌丝室加¹³C_1，2乙酸钠+¹⁵NO₃后，随着氮源的增加，其自由精氨酸浓度提高为54.2%±19.3%，菌根蛋白质中精氨酸浓度变化不大；同时菌根组织的精氨酸和蛋白质中C/N同位素标记丰度大大提高。说明菌丝室增加可利用碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成，但是不清楚精氨酸合成是在根内菌丝还是寄主根内合成为主。在AM真菌共生系统施加有机质，可以部分分解为氨基酸和有机酸（乙酸等）等再被菌丝吸收利用，减少从寄主吸收碳水化合物，从而缓解AM真菌对寄主生物量的抑制作用。

3.3 AM真菌吸收不同氮素对寄主植物生长的影响

大田试验中，本研究发现在低磷条件下，接种AM真菌并添加硝酸钾后，菌根化玉米茎叶重明显提高。硫酸铵则不如硝酸钾对AM真菌菌根化甜玉米株重的促进作用，尿素则降低了13.02%，但是尿素再加有机肥则可以缓解这种生物量抑制作用。Thirkell等^[27]也报道了AM真菌菌丝接触有机质后可以提高寄主植物氮和磷水平，同时也提高了寄主生物量。

在高磷条件下，接种AM真菌并添加硝酸钾后，菌根化玉米穗重明显提高；硫酸铵则不如硝酸钾，尿素在高磷下则减少其生物量11.97%，施加有机肥则缓解抑制作用，反而提高3.52%。相比较，国内邓胤等^[14]研究了不同氮磷水平对玉米生长的影响，以NH₄NO₃为氮源，在高浓度外界氮和磷下，接种AM真菌对玉米营养无贡献，只有在正常氮浓度2 mol·L^–1时，显著提高生物量。显然，该作者没有区别AM真菌对不同无机态氮素的吸收差别。冉琼和钟章成^[28]则发现AM真菌能够通过促进玉米幼苗N、P吸收及叶绿素含量增加，光化学效率、气孔导度增大，从而提高玉米幼苗光合作用能力促进生长。

相比${\rm{NO}}_3^ - $，植株根系同化${\rm{NH}}_4^ + $，需要更多的碳水化合物，而AMF也需要从根组织获得碳水化合物（糖和脂类）进行生长繁殖，即${\rm{NH}}_4^ + $和AMF竞争根组织中的碳水化合物，因而植株供应${\rm{NH}}_4^ + $时会抑制AMF生长，也会减少植株生物量。Yoneyama等^[29]发现低浓度的外界氮能增加高粱（Sorghum vulgare）根分泌的独角金内酯（strigolactones，一种根系分泌物），并且提供单一的${\rm{NO}}_3^ - $为氮源诱导根系分泌独角金内酯的量较${\rm{NH}}_4^ + $高，提高约1倍。这样导致施加${\rm{NO}}_3^ - $可以增加AM真菌菌丝生长并提高吸收养分传递给寄主的能力。

4 结论

AM真菌对铵和硝态氮的吸收和转运有两种不同模式，对于铵态氮（${\rm{NH}}_4^ + $和尿素），AM真菌通过根外菌丝内谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途径被吸收利用的，而吸收的氮大都整合入精氨酸（Arg）分子，合成的精氨酸可以被AM真菌根外菌丝完整地运转至根内菌丝，而且可以在菌丝体内双向运转，再将被输送的精氨酸通过尿素循环（urea cycle）释放出N，以${\rm{NH}}_4^ + $形式传递给植物寄主。对于硝态氮${\rm{NO}}_3^ - $，则除了小部分被ERM吸收还原为${\rm{NH}}_4^ + $进入尿素循环，大部分则是通过根外菌丝转运（可以排除菌丝扩散作用，经检测培养基中${\rm{NO}}_3^ - $浓度很低，数据未发表）至IRM的丛枝结构（检测菌根组织中积累了${\rm{NO}}_3^ - $，数据未发表），进而推测在硝酸盐还原酶（Nitrate reductase）和亚硝酸盐还原酶作用下形成铵，再传递给寄主植物利用（硝酸还原酶基因表达数据；宿主植物受到AM真菌诱导的铵吸收转运蛋白基因的表达数据在后续文章中发表）。这个新模式是首次报道了硝态氮${\rm{NO}}_3^ - $转运吸收途径。

尽管AM真菌根外菌丝对${\rm{NH}}_4^ + $的吸收速率是${\rm{NO}}_3^ - $的10倍，但是农田试验中发现对寄主植物氮素营养及生长的影响并不是一致的。无论在高磷和低磷土壤中，施加${\rm{NH}}_4^ + $态氮降低寄主生物量，而施加${\rm{NO}}_3^ - $态氮则促进寄主生物量，施加尿素和有机肥可以缓解铵或尿素对寄主生长的抑制作用。这说明了AM真菌共生系统对硝态氮${\rm{NO}}_3^ - $的吸收和转运模式更有利于寄主植物的生长，其潜在的不同作用机制有待进一步用系统的基因组学、转录组学和代谢组学等方法研究阐明。该结论将对高效利用AM真菌生物肥料，提高农作物种植产量具有重要指导意义。

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