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  土壤学报  2021, Vol. 58 Issue (2): 505-513  DOI: 10.11766/trxb201906190319
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引用本文  

葛江飞, 杨为中, 高雄飞, 等. 不同经营强度下毛竹丛枝菌根共生体对氨氧化微生物的影响. 土壤学报, 2021, 58(2): 505-513.
GE Jiangfei, YANG Weizhong, Gao Xiongfei, et al. Impacts of Mycorrhiza Symbionts on Ammonia-Oxidizing Microorganisms as Affected by Management Intensity of Phyllostachys pubescens Forests. Acta Pedologica Sinica, 2021, 58(2): 505-513.

基金项目

国家自然科学基金项目(No.41671252)和杭州市农业与社会发展科研项目(No.171937)资助

通讯作者Corresponding author

秦华, E-mail:qinhua@zafu.edu.cn

作者简介

葛江飞(1994-), 女, 安徽安庆人, 硕士研究生, 主要从事土壤生物与生态功能调控研究。E-mail:Gejfei1994@163.com
不同经营强度下毛竹丛枝菌根共生体对氨氧化微生物的影响
葛江飞1,2, 杨为中1,2, 高雄飞1,2, 孙思哲1,2, 陈俊辉1,2, 梁辰飞1,2, 徐秋芳1,2, 邬奇峰3, 秦华1,2    
1. 浙江省森林生态系统碳循环实验室, 浙江农林大学, 浙江临安 311300;
2. 浙江农林大学环境与资源学院, 浙江临安 3113003;
3. 浙江省临安区农业技术推广中心, 浙江临安 311300
摘要:利用原位微宇宙试验将丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza,AM)真菌菌丝与根系区分,设置菌根室(RA)和菌丝室(AH)两个分室处理,以粗放经营(extensive management,EM)毛竹林为对照,研究集约经营(Intensive management,IM)条件下毛竹林土壤丛枝菌根共生体对氨氧化微生物群落的影响及其响应机理。结果表明,无论集约经营还是粗放经营AH处理土壤pH均显著降低,且集约经营毛竹林AH处理土壤碱解氮显著降低;不同分室处理对硝化势没有显著影响,但集约经营毛竹林RA处理土壤硝化势显著高于粗放经营;集约经营之后RA和AH处理的氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)基因丰度显著降低,而氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)基因丰度则在两种经营强度的AH处理中显著降低。不同经营强度和分室处理并未对氨氧化微生物群落组成结构产生显著影响,但网络分析显示集约经营毛竹林氨氧化微生物之间的互作和共生关系优于粗放经营,粗放经营毛竹林氨氧化微生物之间的竞争更为激烈。研究结果为更好地理解毛竹林AM真菌与氨氧化微生物之间的互作关系提供了理论基础。
关键词毛竹林    集约经营    菌根共生体    氨氧化微生物    
Impacts of Mycorrhiza Symbionts on Ammonia-Oxidizing Microorganisms as Affected by Management Intensity of Phyllostachys pubescens Forests
GE Jiangfei1,2, YANG Weizhong1,2, Gao Xiongfei1,2, SUN Sizhe1,2, CHEN Junhui1,2, LIANG Chenfei1,2, XU Qiufang1,2, WU Qifeng3, QIN Hua1,2    
1. Zhejiang Provincial Laboratory of Carbon Cycling in Forest Ecosystems, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin'an, Zhejiang 311300, China;
2. School of Environmental and Resources, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin'an, Zhejiang 311300, China;
3. Agricultural Technology Extension Centre of Lin'an City, Zhejiang Province, Lin'an, Zhejiang 311300, China
Abstract: 【Objective】In this comparative study, impacts of soil arbuscular mycorrhizal symbionts on ammonia-oxidizing microbial communities and their response mechanism in moso bamboo (Phyllostachys pubescens) groves different in management intensity were investigated, in an attempt to provide a theoretical basis for scientific and rational application of nitrogen fertilizer in moso bamboo forests and contribution to mitigation of global climate change.【Method】Sample sites of bamboo groves similar in standing condition but different in management intensity, intensive and extensive, were selected for this field experiment, in each site, four 10 m×10 m quadrats or sample plots were set up, and in each sample plot two microcosmic systems were built up with PVC and nylon nets different in mesh number. With the aid of the microcosmic system, mycorrhiza fungal mycelia were separated from the mycorrhizal root system into two compartments:the mycorrhizal chamber (RA) and the mycelial chamber (AH). Once the systems were fixed, they were left in the soil and cultured in situ for 3 months. Soil samples were collected from the microcosmic systems with a soil auger for analysis in the laboratory. The soil samples were prepared into suspensions, (1:2.5=soil:water) for determination of soil pH with a pH meter; Alkali-hydrolyzale nitrogen (AN) was determined with the alkali-hydrolyzed diffusion method; available phosphorus (AP) was extracted with ammonium fluoride and hydrochloric acid solution and determined with a molybdenum-antimony colorimetry; available potassium (AK) was determined with the flame photometric method; soil organic C (SOC) with the potassium dichromate oxidation method; Soil nitrification potential with the aerobic culture method; copy numbers of amoA gene of ammonia-oxidizing archaea and bacteria with the Real-time quantitative PCR; and ammonia-oxidizing microbial community with the high-throughput sequencing technique.【Results】Results show that both intensive management and extensive management reduced significantly soil pH in the mycelial chambers (AH) in the moso bamboo forest, and only intensive management did soil alkali-hydrolyzed nitrogen in the mycelial chamber (AH). No significant difference was found between the two compartments of the same system in nitrification potential, but the soil nitrification potential in the mycorrhizal chamber (RA) in the bamboo forest was significantly higher under intensive management than under extensive management. AOA in the mycorrhizal chamber and mycelium chamber was significantly lower in gene abundance under intensive management than under extensive management, while AOB in the mycelium chambers was significantly decreased in gene abundance regardless of management intensity. Ammonia-oxidizing microbial communities did not vary much in composition or structure in either chamber under either management. However, network analysis shows that the ammonia-oxidizing microorganisms in the bamboo forest under intensive management displayed better interaction and symbiosis relationship, but less competition than those in the bamboo forest under extensive management.【Conclusion】To sum up, AM mycelia significantly reduce soil pH and AN content in intensively managed moso bamboo forests. Intensity of forest management does have significant impacts on nitrification potential, which however does not differ much between the two mycorrhizal compartments. Intensive management has significant effects on gene abundance of AOA and AOB in the AM mycelial compartment. Although management intensity does not have much impact on structure of the ammonia-oxidizing microorganism community in the soil, intensive management does dull nutrient competition among ammonia-oxidizing microorganisms to a certain extent.
Key words: Phyllostachys pubescens forest    Intensive management    Mycorrhizal symbiont    Ammonia-oxidizing microorganism    

毛竹(Phyllostachys pubescens)生长周期短、用途广泛、经济价值高,已经成为我国南方地区尤其是山区农民的主要经济来源之一。近二十余年,为追求更高的经济效益,大量毛竹林由粗放经营模式逐渐转变为集约经营,主要措施为大量施用氮肥、深翻土壤以及林下清除灌木和杂草等,从而获得更高的竹材和竹笋产量。集约经营模式虽然增加了农户的经济收益,但是大量施用氮肥也带来了土壤酸化、微生物活性降低以及水体富营养化等一系列环境问题[1]。此外,已有学者研究发现毛竹林施肥、翻耕等集约经营措施也会导致土壤某些功能菌群如固氮菌和氨氧化微生物的群落结构发生显著改变[2],对土壤氮循环产生不利影响并且会加剧温室气体排放[3]

丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza,AM)真菌是自然界分布最广泛的一类菌根真菌,能侵染超过80%的高等陆生植物根系,帮助宿主植物提高水分及养分利用效率[4]。由于氨氧化微生物是化能自养微生物,早期研究表明,AM真菌对土壤氨氧化微生物没有影响[5]。但近年来有研究发现,AM真菌可能通过与氨氧化微生物竞争土壤中的有效氮(NH4+)从而影响氨氧化微生物的丰度及群落[6-8]。Teutscherova等[7]的室内培养实验研究发现接种AM真菌处理的土壤中氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing bacteria,AOB)的丰度显著上升,其他许多研究结果也表明AM真菌对AOB丰度的影响是积极的[9-11],并且AOB的群落结构也会因为AM真菌的存在发生显著的改变[12]。但也有一些研究发现AM真菌的存在会对氨氧化微生物产生负面的影响[6, 13-14],并且这些负面的影响大多数是在土壤NH3较低的情况下发生的,如土壤肥力低或者土壤pH较低土壤中的氨多以NH4+的形式存在,不利于被氨氧化古菌(Amonia-oxidizing archaea,AOA)或者AOB利用。

虽然在菌根共生过程中AM真菌与氨氧化微生物之间的养分竞争假设已成为目前较为流行的观点,但是这些研究未将AM真菌与根系的效果分开,因此无法准确评估AM真菌与根系对氨氧化微生物群落演变的贡献。此外,在不同的毛竹林经营强度下,菌根对氨氧化微生物影响如何目前尚未有明确的结论。因此,本研究利用原位微宇宙试验,研究毛竹林生态系统中丛枝菌根及菌丝对氨氧化微生物群落的影响及其对毛竹经营强度的响应机制,为毛竹林科学合理施用氮肥,减缓全球气候变化提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

试验地点位于浙江省杭州市临安区青山镇(119°42′ E,30°14′ N),海拔50 m,属亚热带季风气候,温暖湿润,光照充足,年降水量1 420 mm,年均气温约15.6 ℃,年均无霜期约230 d,地形为低山丘陵,土壤类型为红壤。选取集约经营毛竹林作为研究对象,同时选取附近立地条件相似的粗放经营毛竹林作为对照。集约经营毛竹林的经营措施主要是隔年采伐老竹留养新竹,去除林下灌木、杂草,并对毛竹进行钩梢。每年6月中下旬采用撒施的方式对毛竹林进行施肥,然后进行深翻,化肥用量为:尿素(CO(NH22)450 kg·hm–2、过磷酸钙(Ca(H2PO42)450 kg·hm–2、氯化钾(KCl)150 kg·hm–2。粗放经营毛竹林不施肥,隔年采伐老竹留养新竹,林下植被主要有连蕊茶(Camellia cuspidate)、狗脊蕨(Woodwardia japonica)、兔儿伞(Syneilesis aconitifolia)、络石(Trachelospermum jasminoides)、白花败酱草(Patriniavillosa)、宝铎草(Disporum sessile)等。

1.2 试验设计

于2017年6月分别在集约经营和粗放经营的毛竹林样地各建立4个10 m×10 m的样方,各样方之间距离均大于30 m,共计8个样方。在每个样方内设置2个不同的微宇宙系统,共计16个。微宇宙系统由PVC筒(直径16 cm,高度20 cm)和尼龙筛网制成,PVC筒壁上开有8个孔(4个6 cm孔径和4个3 cm孔径),底部开有4个孔(6 cm孔径),所有的孔均安装有不同孔径的尼龙筛网以区分不同菌根分室处理,其中2 mm孔径的筛网可以使得毛竹细根及AM真菌菌丝均能通过(+细根+AM真菌),设为菌根室(RA)处理;35 μm孔径的筛网仅允许AM真菌菌丝通过(-细根+AM真菌),设为菌丝室(AH)处理。分层取出样地0~20 cm土壤,去除明显的植物根系及石块,放置好PVC筒后,再尽快按照原来顺序将土壤分层放入筒内。在微宇宙系统布置完成后原地培养3个月,用土钻采集微宇宙系统内土壤带回实验室进行分析。鲜土样混合后过2 mm筛,一部分土壤立即进行DNA提取及硝化势的测定,另一部分风干进行理化性质分析。

1.3 土壤理化性质及硝化势测定

土壤理化性质参照鲁如坤等[15]方法:土壤有机质采用重铬酸钾-硫酸外加热法测定;碱解氮采用碱解扩散法测定;有效磷采用盐酸-氟化铵溶液浸提,钼锑抗比色法测定;速效钾采用醋酸铵提取,火焰分光光度计测定;土壤pH采用水土比2.5:1,玻璃电极法测定。

土壤硝化势的测定采用好气培养法[16]并作略微修改。称取10 g新鲜土样置于锥形瓶中,加入(NH42SO4调节NH4+-N浓度到400 mg·kg–1,以干土计算,将含水量调节至田间最大持水量的60%,同时以不加(NH42SO4溶液的土壤作为对照。将锥形瓶放于25 ℃的培养箱中避光培养48 h,培养结束后,用50 mL 1 mol·L–1KCl溶液浸提并过滤,流动分析仪测定NO3-N含量。

1.4 土壤DNA提取及定量PCR

土壤总DNA的提取采用MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit试剂盒(MoBio Laboratories,美国),称取0.5 g冷冻干燥土壤样品,按照试剂盒说明提取DNA。提取的DNA片段大小经1%(m/v)的琼脂糖凝胶电泳检测,并用微量分光光度计(NanoDrop ND-1000,Thermo Scientific,美国)进行浓度测定,保存于–40 ℃用于后续分析。

使用CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad)仪器进行氨氧化古菌和氨氧化细菌amoA功能基因实时定量分析,以确定样品的基因拷贝数。AOA和AOB amoA基因的PCR扩增采用的引物对分别是Arch-amoAF:5′-A ATGGTCTGGCTTAGACG-3′/Arch-amoAR:5′-GCGGCCATCCATCTGATTGT-3′和amoA-1F:5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′/amoA- 2R:5′-CCCCTCGGGAAAGCCTTCTTC- 3′[17],每个样品3个重复,反应体系为:2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL,50 μmol·L–1上游引物和下游引物各0.2 μL,DNA模板1.0 μL,无菌水补足至20 μL。AOA和AOB的扩增程序见参考文献[18]

1.5 高通量测序及数据处理

采用带barcode的AOA和AOB特异性引物,利用Illumina Miseq平台进行高通量测序,测序服务委托杭州联川生物技术有限公司完成。用QIIME2将Miseq测序完成后得到原始的下机数据进行处理,利用overlap将双端数据进行拼接,并进行质控、嵌合体过滤,获得高质量的有效数据。对最终获得的有效数据采用Vsearch2.3.4算法按照97%的相似度聚类,为了降低假阳性率,过滤掉singleton序列,获得最终的OTU丰度及代表序列,进一步进行多样性分析、物种分类注释和差异分析等。

1.6 数据分析

采用SPSS19.0对土壤理化性质、硝化势、AOA和AOB amoA基因拷贝数、α多样性指数以及优势属相对丰度均进行单因素方差分析(One-way analysis of variance)和双因素方差分析(Two-way analysis of variance)比较各处理之间的差异显著性(P < 0.05)。对土壤理化性质与AOA和AOB的amoA基因拷贝数进行Pearson相关性分析。采用R语言Vegan包对不同处理土壤AOA和AOB群落结构进行非度量多维尺度转换排序分析(Non-metric multidimensional scaling,NMDS),并通过相似性检验(Analysis of similarities,ANOSIM)检验不同群落之间的差异显著性(P < 0.05)。为了进一步了解经营强度和不同分室处理对氨氧化微生物种群之间相互作用的影响,利用MENA平台对OTU丰度进行网络分析。

2 结果 2.1 土壤理化性质及硝化势

无论是集约经营还是粗放经营毛竹林,AH处理土壤pH均显著低于RA处理(P < 0.05)。集约经营毛竹林AH处理土壤碱解氮也显著低于RA处理(P < 0.05),有机质及其他养分含量均未发生显著变化(表 1)。与不同分室处理相比,不同经营强度对土壤养分含量的影响更为明显。集约经营毛竹林RA处理土壤有机质、pH显著低于粗放经营毛竹林,而碱解氮含量显著高于粗放经营毛竹林土壤。同时,集约经营毛竹林AH处理土壤有效磷和速效钾含量显著高于粗放经营毛竹林,而pH显著降低(P < 0.05)。双因素方差分析结果表明,经营强度和分室处理均显著影响土壤pH和碱解氮含量,但两者没有显著的协同效应(表 1)。

表 1 毛竹林土壤理化性质及硝化势 Table 1 Soil physic-chemical properties and nitrification potentials of the Moso bamboo forest relative to management intensity(mean±SD, n=3)

在同一类型毛竹林中,不同分室处理之间土壤硝化势均没有显著差异(表 1),而集约经营毛竹林RA处理土壤硝化势显著高于粗放经营毛竹林(P < 0.01)。双因素方差分析结果表明,经营强度对硝化势影响显著(P < 0.01),不同分室处理对硝化势影响不显著,但两者对土壤硝化势具有显著的协同作用(P < 0.05)。

2.2 氨氧化微生物amoA基因丰度

荧光定量PCR结果显示,无论是集约经营还是粗放经营,不同分室处理之间毛竹林AOA的基因丰度均无显著差异(图 1)。而在同一分室处理条件下,集约经营毛竹林RA和AH的AOA基因丰度均显著高于粗放经营(P < 0.05)。双因素方差分析结果表明,经营强度对AOA基因丰度影响显著(P < 0.01)。

图 1 毛竹林土壤AOA及AOB基因丰度 Fig. 1 Abundance of AOA and AOB in Moso bamboo forest soils relative to management intensity

无论是RA处理还是AH处理,AOB在不同经营强度毛竹林之间均无显著差异(图 1)。在同一经营强度下,无论是集约经营还是粗放经营,RA处理土壤AOB基因丰度均显著高于AH处理(P < 0.05)。双因素方差分析结果表明,经营强度和分室处理均对土壤AOB基因丰度影响显著(P < 0.05),两者交互作用也达到显著水平(P < 0.05)。

2.3 氨氧化微生物amoA基因丰度与土壤理化因子及硝化势的相关性

对氨氧化微生物丰度与土壤理化因子及硝化势的Pearson相关性检验结果表明,AOA丰度与硝化势、碱解氮显著正相关,与土壤pH显著负相关,而AOB丰度则与土壤有机质和pH显著正相关(表 2)。

表 2 氨氧化微生物基因拷贝数与土壤理化及硝化势相关性分析 Table 2 Correlation analysis of abundance of ammonia oxidizers with soil properties and soil nitrification potential