2021, Vol. 58
表1(Table 1)
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
硝化作用是造成农田氮素损失、地表和地下水源污染的主要途径[1]。在农业生产实践中常通过施入合成硝化抑制剂来降低土壤硝化作用，但由于成本过高、增产不显著、性能不稳定等因素未能得到广泛应用[2-3]。由植物自身合成和分泌的生物硝化抑制剂，能在根系持续精准释放，环境友好，效果稳定，近年来受到广泛关注[4-6]。1, 9-癸二醇是从水稻根系分泌物中分离鉴定出的一种新型生物硝化抑制剂，可减少温室气体N2O的排放，具有提高农田氮素利用率和减少温室气体排放的应用潜力[7-8]。硝化抑制剂在土壤中的稳定性是影响其应用效果的重要因素之一，建立一种高效、快速、准确的提取和检测方法是评价其作用效果稳定性的前提，但土壤中1, 9-癸二醇的提取方法未有报道，制约了1, 9-癸二醇在土壤中作用效果稳定性的评价。
土壤中有机物质的提取方法有索氏提取法、加速溶剂萃取法、超临界萃取、超声波提取法等。其中，索氏提取法虽为经典的提取方法，但由于提取效率较低、时间长、提取溶剂用量大而被一些新兴提取方法替代[9]；超临界萃取虽具有较高的提取效率，但仪器复杂且花费较高[10]；加速溶剂提取技术测定结果准确，但一次性设备投资较大[11]，因而在日常分析中这些提取技术并不普遍应用。超声波提取技术利用超声波高强度的声能量，增强了提取剂的穿透能力，增大被提取成分分子的运动速率和频率，使溶质快速溶解于溶剂，促使提取有效、高速进行，具有提取时间短、效率高、设备花费低的特点，因而被广泛应用于环境样品提取[12-13]。综合不同提取方法消耗的时间、溶剂、人工和仪器成本，超声提取法具有明显的应用优势，但超声提取所选用的溶剂类型、溶剂体积、提取时间和提取次数等均会影响提取效率[14]，因此，超声法提取土壤中生物硝化抑制剂1, 9-癸二醇的方法有待进一步探索。
作为一种脂肪醇类化合物，1, 9-癸二醇可利用气相色谱进行定量分析。Sun等[8]利用Agilent 6890气相色谱和Agilent 5975质谱联用，分离鉴定出了水稻根系分泌物中的1, 9-癸二醇，并比较了不同水稻品种根系分泌物中的含量；Zhang等[15]利用Agilent 7890对1, 9-癸二醇的衍生化反应条件进行了优化，并分析了影响水稻根系分泌该物质的因素。随着色谱技术的快速发展与色谱仪器的更新，Agilent 8890相比于Agilent 6890和Agilent 7890灵敏度更高，检测限更低，可实现常量、微量甚至痕量样品的检测和定量分析，但利用Agilent 8890测定1, 9-癸二醇的方法有待进一步开发。综上，本文旨在开发土壤中1, 9-癸二醇提取方法的基础上，对气相色谱Agilent 8890测定1, 9-癸二醇的各个参数进行优化，从而建立一套完整的超声波提取-气相色谱检测土壤中1, 9-癸二醇的分析方法，为土壤中1, 9-癸二醇后续研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 供试土壤供试土壤为发育于湖积物的潴育型水稻土，土壤采集自江苏宜兴（31° 16′ N，119° 54′ E），理化性质见表 1。
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表 1 供试土壤理化性质 Table 1 Physico-chemical properties of tested soil |
化学标准品1, 9-癸二醇，定制于公司，纯度大于95%，常温下为液态黏稠物质。有机试剂乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷为色谱纯，石油醚（沸程60 ℃~90 ℃）为分析纯，均产自上海安谱实验科技股份有限公司。
样品前处理仪器为数控超声波清洗器（XO25-12DJ，ATPIO，中国）、防腐型12位氮吹仪（EFAA-DC12-RT，ANPEL，中国）、旋转蒸发仪（N-1100D-WD，EYELA，日本）；样品测定仪器为气相色谱仪（Agilent 8890，美国。包括HP 8890气相色谱、HP 7693自动进样器，Agilent）。
1.3 气相色谱测定1, 9-癸二醇试验设计 1.3.1 1, 9-癸二醇标准溶液的配制用色谱级正己烷准确配制1 mg·mL–1的1, 9-癸二醇标准溶液，依次取0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL的标准溶液于容量瓶中，用色谱级正己烷稀释定容至10 mL，即为10.00~100.00 µg·mL–1的1, 9-癸二醇标准使用液。
1.3.2 气相色谱测定条件优化采用装备有氢火焰离子化检测器（FID）的Agilent 8890工作站，参考Zhang等[15]利用Agilent 7890测定1, 9-癸二醇的方法，初始运行参数如下：毛细管色谱柱HP-5（25 m×0.2 mm×0.33 µm）；进样口温度250℃；不分流进样；初始柱温60℃，保持2 min，以10℃·min–1的速率升至150℃，然后以3 ℃·min–1的速率升至195 ℃，保持2 min，最后以20 ℃·min–1的速率升至270 ℃；载气为氮气，柱流量1.5 mL·min–1；进样量2 µL。在初始条件的基础上设置进样口温度（200、220、240、250、260、270 ℃）、检测器温度（260、270、280、300、310、320 ℃）、升温程序（表 2）进行优化。1, 9-癸二醇浓度10 µg·mL–1，每个条件设置6个重复，考察以上参数的改变对其峰面积的影响。
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表 2 气相色谱测定1, 9-癸二醇的升温程序 Table 2 Temperature raising procedure of GC in determination of 1, 9-decanediol |
土壤风干研磨后过2 mm筛，称取1.00 g于离心管中，逐滴加入配制浓度为2 mg mL–1的1, 9-癸二醇标准溶液0.5 mL，参考硝化抑制剂稳定性实验设置[16]，将体系静置1 h，使溶液充满整个土壤孔隙，与土壤充分接触但又不会发生降解转化。该加标土壤样品的1, 9-癸二醇浓度为1 000 mg·kg –1，并作为后续超声提取条件优化实验的浓度。
土壤中1, 9-癸二醇的超声提取（1）提取试剂的选择：将上述1 000 mg·kg –1加标土壤样品用不同提取试剂（水、乙腈、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、石油醚）进行超声提取，每个条件设置4个加标平行样品。液料比40 mL· g–1，超声处理30 min，离心（6 000 r∙min–1）5 min，上清液过滤后转移至茄形瓶中，土壤残渣按上述过程再进行两次处理，即共提取3次。将三次提取液置于旋转蒸发仪上40℃蒸发至干，残余物用正己烷溶解，经0.22 µm有机滤膜过滤后定容至10 mL。取适量用气相色谱以标准曲线法测定土壤中1, 9-癸二醇含量并计算回收率，比较不同提取剂对土壤1, 9-癸二醇回收率的影响。（2）提取次数的选择：以甲醇作为提取剂，液料比40 mL· g–1，超声处理30 min，提取次数分别为1次、2次、3次，其他操作步骤同1.4.2（1），比较提取次数对土壤1, 9-癸二醇回收率的影响。（3）液料比的选择：以甲醇作为提取剂，超声处理30 min，提取1次，液料比分别为10、20、30、40、50 mL· g–1，其他操作步骤同1.4.2（1），比较液料比对土壤1, 9-癸二醇回收率的影响。（4）超声时间的选择：以甲醇作为提取剂，液料比40 mL·g–1，提取1次，超声处理时间分别为10、20、30、40、50 min，其他操作步骤同1.4.2（1），比较超声时间对土壤1, 9-癸二醇回收率的影响。
1.5 不同浓度1, 9-癸二醇加标回收率试验设计按照1.4.1方法配制浓度为10、100、1 000 mg·kg–1的加标土壤，以甲醇作为提取剂超声提取1次，液料比40 mL· g–1，超声时间30 min，其他操作步骤同1.4.2（1），测定不同浓度1, 9-癸二醇的加标回收率。
1.6 统计分析气相色谱数据通过Agilent Openlab Data Analysis 2.4完成，实验数据利用Microsoft excel 2007和SPSS 22.0进行数据统计和分析，用最小显著差异法（LSD）分析各处理间的差异显著性，不同的小写字母表示处理间有显著差异（P < 0.05）；使用Origin 2017绘制图表，图表中数据均为平均值±标准差。
2 结果与讨论 2.1 气相色谱测定1, 9-癸二醇条件优化气相色谱进样口温度、检测器温度、升温程序对1, 9-癸二醇的响应值影响如图 1所示。物质在气相色谱的响应值越高，则检测灵敏度越高，越有利于分析[12]。随着进样口温度升高，1, 9-癸二醇响应值逐渐升高后又有所降低，这说明当进样口温度较低时待测组分未完全汽化，温度过高时物质发生分解，从而导致1, 9-癸二醇部分损失而不利于测定，因此参考初始条件，选择250 ℃为较适宜的进样口温度。检测器温度过低，组分分子电离数目少，产生电流信号小，导致灵敏度降低，过高会影响其使用寿命，一般检测器温度要高于组分沸点50 ℃以上，保证流出色谱柱的组分不冷凝[17]，因此检测器温度310 ℃为适宜的测定条件。柱温是影响物质分离效果、峰形的重要因素，一般毛细管柱分析多组分时多采用程序升温。虽升温程序3和4均能使得1, 9-癸二醇达到较高的响应值，但升温程序3需运行31.75 min，升温程序4运行时间仅23 min，可缩短样品分析时间，提高测定效率。综上，气相色谱测定1, 9-癸二醇的最优化条件为：进样口温度250 ℃，检测器温度310 ℃，升温程序：初始柱温60 ℃，保持2 min，以20 ℃·min–1的速率升至150 ℃，然后以3 ℃·min–1的速率升至180 ℃，保持2 min，最后以20 ℃·min–1的速率升至270℃。
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图 1 1, 9-癸二醇在气相色谱不同测定参数下的响应 Fig. 1 Determination of 1, 9-decanediol relative to gas chromatography parameters |
标准曲线：依次取10~100.00 µg·mL–1的标准使用液，并以溶剂正己烷作为参比，按最优化条件进行测定，以1, 9-癸二醇的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，标准曲线如图 2所示。在所取浓度范围内，1, 9-癸二醇的浓度与峰面积之间线性关系良好，线性方程y=26.81x–9.678，R2=0.999。10 µg·mL–1标准样品的气相色谱图如图 3所示，色谱图基线平稳，1, 9-癸二醇的保留时间Rt为9.895 min，且色谱峰无前延或拖尾现象，呈高斯对称，峰形较好，符合色谱分析要求[17]。
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图 2 1, 9-癸二醇标准曲线 Fig. 2 Standard curve of 1, 9-decanediol |
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图 3 1, 9-癸二醇的气相色谱图 Fig. 3 Standard chromatograms of 1, 9-decanediol |
仪器精密度：加标浓度为40.00 µg·mL–1，在仪器最优条件下，日内和日间平行测定6次加标样[17]，结果如表 3所示，日内精密度和日间精密度RSD < 5%，说明该方法精密度良好。
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表 3 仪器精密度及方法检出限、回收率 Table 3 Precision, detection limit and recovery rate of the instrument |
仪器检出限：以3倍信号噪声比对应的样品浓度，与较低的相近浓度的标样信号值相比较，计算得仪器的最低检出限为0.03 µg·mL–1。
测定方法回收率：加标量为10 µg·mL–1，连续测定6个加标样，按上述线性方程计算得相应目标物的测定浓度，得回收率为95.94%，符合有机样品的分析要求。
2.3 超声提取后土壤中1, 9-癸二醇的气相色谱图按照1.4.2方法对空白土壤和添加1 000 mg·kg–1标样土壤中的1, 9-癸二醇进行提取，利用上述优化的气相色谱测定方法进行测定，气相色谱图如图 4所示。保留时间在9.5 min~10.5 min范围内，空白土壤的色谱图中仅有一段平稳的基线，未出现任何色谱峰，因此空白土壤中未检测到1, 9-癸二醇；添加标样土壤的色谱图在该时间段内仅出现一个清晰且分离度高的色谱峰，保留时间Rt为9.900 min，与标准品的保留时间（图 3，Rt为9.895 min）差异在合理的误差范围内[19]，因此该峰是1, 9-癸二醇的色谱峰。
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图 4 空白土壤（a））及添加1 000 mg·kg–1标样土壤（b））的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of original soil samples(a))and soil samples spiked with 1 000 mg·kg–1 1, 9-decanediol(b)) |
除目标峰外，土壤样品的色谱图中也存在少量杂峰，但响应值仅为目标物响应值的1%~3%，且超声提取的回收率达95%，因此，杂峰对目标物定量的干扰很小。在杂质不干扰目标物测定的情况下，不进行提取液净化可减少淋洗液浓缩过程的损失，也可在很大程度上提高工作效率[12，20]，故本方法提取和测定方法可满足实验要求。
2.4 不同提取条件对土壤中1, 9-癸二醇提取效果的影响 2.4.1 提取溶剂不同提取溶剂对1 000 mg·kg–1加标土壤中1, 9-癸二醇的提取结果如图 5所示。由于1, 9-癸二醇属于脂溶性极性化合物，根据相似相溶原理，利用非极性溶剂石油醚、正己烷提取的回收率较低，分别为44.6%和52.4%，水对1, 9癸二醇的提取回收率为77.8%，极性有机溶剂如乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷等提取回收率较高，可达到93%~96%，因此，极性有机溶剂提取土壤中的1, 9-癸二醇效果更好。考虑到以上极性有机溶剂中甲醇的毒性和成本较低，选择甲醇作为提取剂。
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注：WA：水，AN：乙腈，MT：甲醇，AC：丙酮，EA：乙酸乙酯，DCM：二氯甲烷，HEX：正己烷，PE：石油醚。 Note: WA: water, AN: acetonitrile, MT: methyl alcohol, AC: acetone, EA: ethyl acetate, DCM: dichloromethane, HEX: n-hexane, PE: petroleum ether. 图 5 不同提取溶剂对1, 9-癸二醇回收率的影响 Fig. 5 Recovery rate of 1, 9-decanediol relative to extractants |
1 000 mg·kg–1加标土壤经不同次数超声提取后1, 9-癸二醇的回收率结果如表 4所示。以甲醇作为提取剂，超声提取一次后土壤中1, 9-癸二醇的回收率已达到92.5%，再进行二次提取和三次提取后回收率并无显著上升，说明经过一次超声提取后物质的溶出已经趋近饱和，多次提取仅是消耗更多的提取剂，提取和浓缩时间也会加长。因此，为节约溶剂、缩短样品处理时间，确定最适提取次数为1次。
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表 4 提取次数对1, 9-癸二醇回收率的影响 Table 4 Recovery rate of 1, 9-decanediol relative to extraction frequency |
液料比是指提取剂体积与土壤质量的比值。不同液料比对1 000 mg·kg–1加标土壤中1, 9-癸二醇的提取结果如图 6所示。当超声提取一次，液料比从10 mL·g–1增加至40 mL· g–1时，回收率从79.3%提高至95.3%，这说明液料比的扩大可增加土壤与提取剂的接触面积，使得目标物1, 9-癸二醇更充分地溶解出来[21]，而液料比增加至50 mL·g–1后，回收率并无明显变化，但会造成溶剂的浪费，增加样品的浓缩时间，因此为减少提取剂对环境的负面效应、降低实验成本、提高实验效率，确定最佳液料比为40 mL·g–1。
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图 6 液料比对1, 9-癸二醇回收率的影响 Fig. 6 Recovery rate of 1, 9-decanediol relative to liquid/solid ratio |
不同超声时间对1 000 mg·kg–1加标土壤中1, 9-癸二醇的提取结果如图 7所示。超声时间的长短直接影响溶剂与土壤的接触程度，从而影响提取效率[22]。超声时间从10 min增加至30 min时，1, 9-癸二醇的回收率从85.1%上升至90.74%，再延长超声时间至40 min时，回收率（91.07%）略有上升，但与超声30 min相比无显著差异。超声时间超过40 min后，1, 9-癸二醇的提取效率反而下降，这可能是由于随着超声时间的增长，一方面超声过程产生的·OH和·H自由基浓度增大，另一方面在空化过程中形成的超临界态水的氧化作用逐渐增强[23]，因此推测1, 9-癸二醇结构被破坏或者发生氧化降解，该结果与超声提取大豆蛋白[24]、果胶[25]、土壤中除草剂[26]等的结果相似，超声提取时间过长造成一些物质的结构、理化性质等发生变化。因此，综合考虑回收率和样品处理时间成本，超声提取时间控制在30 min即可。
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图 7 超声时间对1, 9-癸二醇回收率的影响 Fig. 7 Recovery rate of 1, 9-decanediol relative to duration of ultrasonic treatment |
综合上述结果，确定超声波提取土壤1, 9-癸二醇的最佳参数为：以甲醇作为提取剂超声提取1次，液料比40 mL·g–1，超声时间30 min。
2.5 不同浓度1, 9-癸二醇的加标回收率为了验证本实验方法的可靠性，设置10、100、1 000 mg·kg–1三个土壤样品的加标浓度。设置依据如下：在水培体系下，不同品种水稻根系分泌1, 9-癸二醇含量0~10 μg·g–1 DW d–1[8]，推算至根际土壤中1, 9-癸二醇的浓度范围为0~60 mg·kg–1[7]，因此设置10 mg·kg–1加标浓度作为土壤中1, 9-癸二醇的自然浓度水平（低浓度水平）。根际微域环境的改变如
将不同加标浓度的土壤样品按照2.2.5所示最优参数超声提取，并测定提取液中1, 9-癸二醇的含量，计算加标回收率，结果如表 5所示。当土壤中1, 9-癸二醇浓度添加从10 mg·kg–1扩大至100 mg·kg–1、1 000 mg·kg–1时，回收率并未发生大幅度的波动，平均值分别为90.58%、93.25%、94.55%，且变异系数CV均小于5%，说明该方法提取水稻土中的1, 9-癸二醇的结果稳定可靠，重复性好。由于不同类型土壤的pH、总有机碳含量、阳离子交换量等理化性质不同，待提取目标物质与土壤有机质的结合能力、在提取体系的存在形式等可能有所不同[32]。然而研究表明，当用甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂提取时，有机溶剂对不同土壤中目标物质的提取效率类似。生弘杰等[33]利用乙酸乙酯提取砖红壤和黄棕壤中的酰基高丝氨酸内酯C7-HSL的回收率分别为87.90%和85.82%；贺仲兵[34]用甲醇提取红壤和潮土中溴硝醇的回收率分别为90.66%、90.44%。这可能是因为溶剂效应强于土壤表面颗粒对物质的吸引力，促使其与土壤表面结合键的断开[35]。由此推测，本研究中利用有机溶剂甲醇超声提取土壤中1, 9-癸二醇的方法也可能适用于不同类型土壤。
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表 5 不同浓度1, 9-癸二醇的加标回收率 Table 5 Spike recovery rate of 1, 9-decanediol relative to concentration |
环境友好的生物硝化抑制剂已成为现代农业中氮肥减施增效的一项新技术。为了评价生物硝化抑制剂在土壤中的应用效果，迫切需要发展简便快速的提取和检测技术。本文建立了一种超声波提取-气相色谱检测土壤中1, 9-癸二醇的方法：以甲醇作为提取剂超声提取1次，液料比40 mL·g–1，提取30 min；气相色谱Agilent 8890进样口温度250℃，FID检测器温度310℃，初始柱温60℃，保持2 min，以20℃·min–1升至150℃，然后以3℃·min–1升至180 ℃，保持2 min，最后以20℃·min–1升至270℃。该方法操作简便、快速高效、回收率高、重复性好。随着今后土壤中根系分泌物原位收集和检测技术的发展，以及1, 9-癸二醇作为绿色氮肥增效剂在农业中的应用，该方法将为农业土壤中1, 9-癸二醇的稳定性和环境效应等评价奠定基础，也为土壤中其他生物硝化抑制剂提取方法的建立提供参考和借鉴。
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