2022, Vol. 59
2. 中国科学院亚热带农业生态研究所亚热带农业生态过程重点实验室, 长沙 410125;
3. 航天凯天环保科技股份有限公司, 长沙 410100;
4. 湖南省土壤肥料研究所, 长沙 410125
2. Key Laboratory of Agro-ecological Processes in Subtropical Region, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
3. Aerospace Kaitian Environmental Technology Co., Ltd., Changsha 410100, China;
4. Hunan Soil and Fertilizer Institute, Changsha 410125, China
硝化过程是全球氮素循环的关键过程之一[1]，是指在微生物的参与下将氨氧化为硝酸的过程。氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea，AOA）和氨氧化细菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）作为驱动土壤硝化作用两步过程中第一步（也是限速步骤）的关键微生物[2]，其种群丰度或群落结构会受到土壤有机碳（SOC）[3]、pH[4]和有效磷（Olsen-P）[5]等多种环境因子以及农业管理措施如施肥[6]的影响。
长期施肥能从系统的角度阐明人为干扰对农田生态系统的反馈和适应，揭示出氨氧化微生物对施肥的响应[7]。有研究[8]表明，长期不施肥和单施有机肥均降低稻田土壤（0~20 cm）全氮（TN）含量和土壤pH。罗培宇等[9]探明长期施用有机肥显著提高棕壤耕层土壤（0~20 cm）养分含量及AOA和AOB的丰度，且有机肥处理下的土壤理化因子含量均高于不施肥和单施化肥处理。徐白璐等[10]指出长期施化肥与有机肥均会显著提高酸性土壤（0~15 cm）SOC含量，且AOA和AOB基因丰度受SOC含量和pH的影响。虽然长期施肥影响稻田土壤及氨氧化微生物的相关研究已有报道，但大多研究均集中于耕作层（0~20 cm）土壤，对长期施肥状态下水稻土理化因子及氨氧化微生物垂直分布特征的研究尚少。
土壤中的碳、氮和磷等是影响土壤肥力和植物生长发育的重要营养元素。大量研究表明，土壤剖面的理化性质具有垂直梯度特征，其中也包括因土壤剖面分化的氧化还原电位，从而影响土壤的硝化作用[11]。骆坤等[12]对黑土进行长期施肥试验中发现，有机肥施入下黑土表层（0~20 cm）和亚表层（0~40 cm）SOC和TN均有所提高。徐虎[13]指出化肥配施有机肥显著提高了长期不施肥红壤、塿土、潮土和黑土0~100 cm土层的磷素含量。研究[14]表明，硝化作用主要发生在土壤0~60 cm的基质层。然而，杨靖民等[15]发现黑土稻田土壤硝化速率在深层土壤剖面（60~80 cm）中仍可高达107.3 μg·（kg·h）–1。AOA和AOB在土壤剖面中存在生态位差异。Tao等[16]发现在中国西北黄土高原土壤剖面中，AOB在表层土壤（0~20 cm）中富集，AOA在底土（20~40 cm和40~60 cm）中最为丰富，且AOB和AOA对高氮的输入响应不同。长期水稻种植和不同施肥措施等导致土壤理化性质沿土壤剖面分化[17]，但目前关于长期施肥如何影响不同土层AOA和AOB的研究仍待深入。
为进一步探究长期施肥对稻田不同土层氨氧化微生物种群丰度及组成的影响，本试验依托湖南省宁乡市稻田不同施肥制度长期定位试验，选取不施肥、施秸秆有机肥、施有机-无机肥以及施全量化肥四种施肥制度，采集0~10、10~20、20~30和30~40 cm土层土壤样品，运用荧光定量PCR（qPCR）和Illumina MiSeq测序技术，系统分析长期施肥状态下稻田土壤氨氧化微生物沿土壤剖面丰度和组成的变化特征及其核心驱动因子。研究结果可为提高稻田氮素利用效率、温室气体减排提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 采样点与样品采集土壤采样地点位于典型双季稻产区的湖南省宁乡市农业技术推广中心（112°18′E，28°07′N），海拔36.1 m，年平均气温为16.8℃，年均降水量为1 554 mm，年均无霜期274 d，年日照时长1 663 h。于1986年设立田间试验，为长期定位施肥实验田。
本研究采用1个对照和3个施肥处理：（1）无肥对照（CK）处理：不施加任何肥料；（2）秸秆有机肥处理（ST）：施用上一年度晚稻收割的水稻秸秆，秸秆还田量为2 775 kg·hm–2，其中N、P2O5和K2O的含量分别为18.04 kg·hm–2、3.61 kg·hm–2和24.70 kg·hm–2，总氮磷钾量不足则用化肥补足；（3）有机-无机肥处理（OM）：60%氮源来源于有机肥（水稻秸秆），40%氮素来源于化肥；（4）全量化肥处理（NPK）：仅施氮磷钾化肥，总施N、P2O5和K2O的含量分别为142.5 kg·hm–2、54.0 kg·hm–2和63.0 kg·hm–2。试验小区面积为28.22 m2，每个处理3次重复，随机区组设计。每个处理采用五点法采集土壤后混合，土壤剖面0~40 cm范围内按10 cm间距分段采样，重复3次。土壤样品剔除石块及植物残茬后过2 mm筛，将土样分为两份：一份用锡箔纸包好立即用液氮速冻，存放于–80℃冰箱，用于分子生物学实验；另一份土样取回后立即测定其理化指标及土壤硝化势。土壤的基本理化性质见表 1。
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表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Characteristics of the soil in this study |
土壤pH采用电位法按水土比2.5︰1用pH计（Mettler-toledo320，上海）测定；SOC和TN参考《土壤农业化学分析方法》[18]分别采用重铬酸钾容量法和半微量凯氏定氮法测定；Olsen-P含量采用0.5 mol·L–1 NaHCO3浸提—钼锑抗比色法测定；碱解氮（AHN）采用1.0 mol·L–1 NaOH水解—碱解扩散法测定。
1.3 硝化势的测定方法土壤硝化势（NP）的测定采用好气培养法[18]并稍作修改，具体如下：取新鲜土壤样品（相当于600 g烘干土重）按100 mg·kg–1（以N计）烘干土质量的比例加入硫酸铵并充分混匀，调节土壤水分至田间持水量的60%。称取200 g土样装入250 mL广口瓶中，每个土样分装三瓶，用扎孔的锡箔纸封口，置于25℃避光培养4周，每周于每个广口瓶中取出5 g土壤，用1 mol·L–1 KCl浸提，流动分析仪（AA3全自动连续流动分析仪，SEAL Analitical，德国）测定土壤NO3–-N含量，并定时向广口瓶中补充失去的水分。
1.4 土壤DNA的提取和实时荧光定量PCR分析土壤DNA的提取采用Fast DNA spin kit for soil（MP Biomedicals，Cleveland，OH，美国）试剂盒，称取0.5 g经冷冻干燥的土样并按照试剂盒操作步骤进行。用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测提取DNA片段大小，用UV-Vis分光光度计（ND-1000，NanoDrop，德国）测定土壤DNA浓度及质量。
实时荧光定量PCR（qPCR）所用仪器为ABI 7900（Applied Biosystem，美国），对AOB、AOA基因进行PCR扩增，具体片段见表 2。PCR反应体系为20 μL，含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM，上、下游引物（10 μmol·L–1）各0.5 μL，2 μL 10倍稀释的DNA模板，加灭菌水补至20 μL。PCR扩增程序为95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火34 s，72℃延伸32 s，共40个循环，最后于72℃延伸5 min。参考Wang等[21]的方法并改进溶解曲线过程：95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。
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表 2 功能基因特异性引物序列 Table 2 Specific primers for functional gene used in this study |
标准曲线采用导入氨氧化细菌或氨氧化古菌amoA功能基因的克隆子质粒制备。目的基因的克隆子接种于溶菌肉汤（LB）培养基中，按照试剂盒（E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit）说明书提取质粒、纯化质粒后，测定质粒的浓度，换算目的基因的拷贝数。最后10倍梯度稀释质粒制作定量PCR的标准曲线。AOB和AOA amoA基因扩增效率分别为94.3%（R2= 0.999）和96.6%（R2= 0.998）。
1.5 Illumina测序和序列分析PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收，Tris_HCL洗脱，2%琼脂糖电泳检测。将PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina测序，测序得到的是双端序列数据，每个样品至少获得3万条有效序列，利用该公司生信云平台进行数据分析。采用MEGA 5.0软件构建系统发育树，建树方法为邻接法（Neighbor-Joining），重复抽样（Bootstrap）设为1 000。
将优势操作分类单元（OTUs）（> 1%）代表序列提交到DNA序列数据库（GenBank），数据库登录号为MW166174~MW166194。
1.6 数据处理与分析SPSS 20.0软件对数据进行处理与统计分析；ORIGIN 9.0软件对图形进行绘制。不同处理显著性用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行检验，利用皮尔森（Pearson）相关分析方法对土壤氨氧化微生物丰度及环境因子进行相关性分析。用Canoco 5软件对数据进行冗余分析（redundancy analysis，RDA），首先进行去趋势对应分析（detrended correspondence analysis，DCA），当排序轴梯度长度（lengths of gradient，LGA）第一轴大于4.0时，适合典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA），当LGA小于3.0时，适合RDA分析，LGA介于3.0~4.0时，选用CCA和RDA分析均可[22]。DCA分析结果显示，AOA第一排序轴长度为3.1，AOB第一排序轴长度为2.0，故本研究采用RDA分析。
2 结果 2.1 长期施肥对稻田土壤基本理化性质及硝化势的影响如图 1所示，长期施肥显著改变了土壤AHN、Olsen-P、pH、SOC和TN的含量。与CK处理相比，施肥处理在0~30 cm土层均显著增加了土壤AHN、Olsen-P、SOC和TN含量（P < 0.05），其中OM处理下增加最多。相较CK、ST和NPK三种处理，OM处理使稻田土壤0~40 cm土层中的Olsen-P含量分别显著增加1.57倍~23.62倍、1.27倍~12.59倍和1.45倍~12.63倍。此外，三种施肥方式较CK处理均降低了土壤pH。随着土壤深度的增加，土壤pH表现出升高趋势。由图 2可见，长期施肥均显著增加各土层NP（P < 0.05），且NP随土层的加深而逐渐减少。0~10 cm土层NP最高，OM处理下NP达到8.91 mg·kg–1·d–1，为CK处理的1.54倍。
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注：不同大写字母代表同一土层不同施肥处理间差异显著，不同小写字母表示同一施肥处理不同土层间差异显著（P < 0.05）。下同。 Note: Different capital letters indicate significant difference at 0.05 level among different fertilization treatment under the same soil layers. Different small letters indicate significant difference at 0.05 level among different soil layers under the same fertilization treatment(P < 0.05).The same below. 图 1 不同施肥处理下不同土壤深度理化性质 Fig. 1 Physical and chemical properties at different soil depths under different fertilization treatments |
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图 2 不同施肥处理对各土层土壤硝化势的影响 Fig. 2 Nitrification potential at different soil depths under different fertilization treatments |
长期施肥影响稻田土壤AOA和AOB的种群丰度（图 3）。在不施肥土壤中不同土层AOB数量均高于AOA的数量，AOB/AOA在9.24~29.19之间；施肥处理下0~40 cm土层AOA占主导作用，其与AOB在0~40 cm各土层的数量比值分别在0.77~3.57、1.27~3.56、1.37~31.28和1.80~5.55之间。不同施肥措施和土层的分化均使AOA和AOB丰度存在显著差异（P < 0.05）。相比CK处理，长期施肥显著提高了各土层中土壤AOA的种群丰度，而不同土层中AOB的种群丰度对长期施肥处理的响应各不相同。在0~10 cm深度土壤中，除OM处理下AOB种群丰度略有增长外，ST和NPK处理均减小了AOB种群丰度；在10~20 cm深度土壤中AOB种群丰度因施肥处理下降；相对于不施肥处理，AOB种群丰度在20~30 cm深度的ST和OM处理中显著增加；在30~40 cm深度土壤中，相比CK处理，除ST降低了AOB种群丰度外，OM和NPK处理均显著增加了AOB种群的丰度。
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注：AOA柱形上所标数字为AOA/AOB值，AOB柱形上所标数字为AOB/AOA值。 Note: The number marked on the AOA columns are the AOA/AOB values. The number marked on the AOB columns are the AOB/AOA values. 图 3 不同施肥处理下不同土壤深度氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）基因丰度 Fig. 3 Gene abundance of ammonia-oxidizing archaea(AOA)and ammonia-oxidizing bacteria(AOB)in different soil depths under different fertilization treatments |
运用Illumina MiSeq测序平台，分别获得三万条AOA和AOB基因的有效序列，利用美吉生信云在线分析平台对AOA和AOB的amoA基因序列进行群落组成分析。选取相对丰度大于1%的OTU构建群落组成图和系统发育树（图 4和图 5）。从AOA、AOB的OTU水平相对丰度变化图可以看出，相比CK处理，在0~40 cm土层中，长期施肥显著富集OTU3、OTU67和OTU1041，ST处理进一步富集OTU2、OTU5、OTU65和OTU101，OM处理富集OTU66和OTU101，NPK处理富集了OTU5、OTU7和OTU65。此外，CK、ST、OM和NPK处理中OTU7、OTU958和OTU1041的丰度随土层深度的增加而减少，而OTU402和OTU948的丰度则随土层深度的增加而增加。
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注：OTUs：操作分类单元。 Note: OTUs: operational taxonomic units.□: CK; △: ST; ○: OM; ▽: NPK. 图 4 不同施肥处理下不同土壤深度AOA和AOB基因群落组成 Fig. 4 Community composition of AOA and AOB at different soil depths under different fertilization treatments |
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注：各支上的数字是1 000次重抽样分析的支持百分比，小于50的省略，括号里的数字为基因序列在Genbank数据库中的登录号。 Note: Values indicate the percentage of 1000 replicate trees supporting the branching order; values below 50 are omitted. The number in parentheses is the Genbank accession number. 图 5 AOA、AOB基因系统发育树 Fig. 5 Phylogenetic trees for AOA and AOB |
通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）等数据库进行序列比对，利用MEGA软件构建系统发育树（图 5）。结果表明AOA的OTU2、OTU65、OTU66和OTU67与Nitrosocosmicus相近，OTU4与Nitrosotalea相近，OTU5与亚硝化螺菌属（Nitrososphaera）相近，OTU6与细小亚硝化菌属（Nitrosotenuis）相近。AOB的OTU499、OTU956和OTU958与亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）相近，OTU101、OTU262、OTU1041和OTU1049与亚硝化叶菌属（Nitrosolobus）相近，OTU402、OTU948、OTU962和OTU1016与亚硝化螺菌属（Nitrosospira）相近。
2.4 AOA和AOB群落结构与土壤理化性质的关系皮尔森相关性分析（表 3）表明，水稻不同深度土壤NP和理化性质如AHN、Olsen-P、SOC和TN与AOA、AOB丰度具有极显著的正相关性（P < 0.01）。而pH与AOA和AOB丰度具有显著负相关性（P < 0.05）。
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表 3 长期施肥水稻土不同深度土壤理化性质与氨氧化微生物丰度相关性 Table 3 Pearson's correlation coefficients between the abundance of AOA, AOB and soil properties at different paddy soil depths under long-term fertilization |
对AOA、AOB种群OTU组成与环境变量进行RDA分析（图 6），结果表明X轴和Y轴分别能够解释AOA和AOB群落结构总变异量的52.67%和70.97%。土壤Olsen-P和pH分别在AOA、AOB第一排序轴上的投影长度较长，表明Olsen-P和pH分别对AOA、AOB种群的多样性组成具有显著影响。CK、ST、OM和NPK处理在AOA种群RDA二维排序图中彼此分离，表明不同施肥措施显著影响氨氧化古菌的群落组成。AOB种群RDA二维排序图显示氨氧化细菌群落结构的分化受施肥的影响差异显著。
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图 6 不同土层中AOA、AOB群落组成和理化及施肥因素的冗余分析（RDA） Fig. 6 Redundancy analysis(RDA)of AOA, AOB community compositions, soil properties and fertilization factors at different soil depths |
长期施肥显著影响稻田土壤不同土层土壤的理化性质[23]。相比于短期施肥，长期施肥会使稻田土壤养分呈垂直分布的形式，养分的适度下移，可使稻田底土肥力系数增高[24]，但当养分下移的程度超过水稻根系所能吸收的范围，就将造成土壤养分流失、地下水污染等危害[25]。CK处理中养分的来源仅靠土壤中根茬的残留，养分不足，难以维持地力，而本研究中肥料的使用尤其是有机-无机肥的施用显著增加了土壤养分含量（图 1），表明施肥能够促进土壤养分的累积。此外，长期施肥均显著降低了土壤pH，且全量化肥的施用在耕作层（0~20 cm）土壤中影响更甚，加剧了土壤酸化，这可能是因为肥料的施入增加了土壤中铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3–-N）的含量，土壤中NH4+的硝化作用或是NO3–的淋溶均会导致土壤中H+浓度的增加[26]。
3.2 长期施肥对土壤氨氧化微生物丰度的影响长期施肥引起稻田各土层环境因子改变的同时，也会导致稻田各土层氨氧化微生物的生理生态功能发生改变。本研究发现，长期施肥均显著提高了各土层AOA丰度（图 3），说明土壤养分的增加能显著促进AOA的生长与繁殖，这可能与AOA对不同施肥方式具有选择性和适应性有关[27]。但是，各土层AOB丰度对施肥响应不一致。不施肥土壤AOB数量在各土层中均高于AOA的数量（图 3），说明在寡营养环境下，AOB是土壤氨氧化作用的主要执行者，这与毛新伟等[28]、曹彦强等[2]的研究结果稍有不同，其原因可能是毛新伟等[28]、曹彦强等[2]研究的土壤呈酸性或中性，而本研究的土壤pH在7.17~7.60之间，在AOB适宜生长pH范围（7.0~8.6）之内。研究发现，AOB数量在水分含量较大的土壤或pH为中碱性的土壤中远超AOA的数量[29]，水稻生长过程反复经历水旱交替致使土壤pH接近中性[30]，施肥导致土壤酸化，从而使对NH3具有较高亲和力并耐受缺氧环境的AOA在酸性稻田土壤中发挥主导作用[31]。此外，通过相关性分析进一步表明，AOA、AOB数量与土壤AHN、Olsen-P、pH、SOC、TN和土壤NP均存在显著相关关系（表 3），表明长期施肥导致的稻田各土层理化性质的差异显著影响AOA、AOB数量，进而影响土壤的硝化能力。土壤AOA和AOB的丰度在0~30 cm深度的ST和OM处理中均较NPK处理为高（图 3），响应了长期施肥下土壤AHN、Olsen-P、SOC、TN含量和NP的变化趋势，符合垂直分布特性，说明0~30 cm土层中秸秆有机肥和有机-无机肥的施用是影响土壤AOA和AOB丰度变化的重要诱因。
3.3 长期施肥对土壤氨氧化微生物群落组成的影响肥料直接施入表土层使土壤表层微生物更易获取到充足的养分，促进AOA、AOB的生长繁殖，随着土壤深度的增加，底层微生物生长受限，数量减少，土壤养分的垂直分布会引起土壤微生物具有垂直分布特征。本研究稻田土壤CK处理下AOA群落优势OTU在不同土层中的比例无明显变化，但三种施肥处理不同程度地改变了各土层中隶属于Nitrosocosmicus、Nitrososphaera、Nitrosotalea和Nitrosotenuis的OTUs比例（图 4），说明长期不同施肥措施导致的土壤碳、氮、磷等养分含量及pH的变化诱导了AOA种群结构的改变。稻田土壤AOB群落在不施肥处理下的优势菌属为Nitrosospira，三种施肥方式增加了Nitrosolobus的比例，同时ST和OM处理显著增加了β-变形菌纲的亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）的比例，研究表明Nitrosomonas易在较高浓度的有机物环境中积累[32]，这与本研究结果（图 4）相符合。RDA分析结果表明，Olsen-P和pH分别对AOA、AOB群落组成的影响具有显著性，其解释度分别为31.5%和46.7%（图 6），说明Olsen-P和pH分别是驱动AOA、AOB群落演替的关键因子；AOA二维排序图中各施肥处理彼此分离，CK、NPK处理中0~10 cm和10~40 cm土层也彼此分离（图 6），证明长期施肥和土层的分化对氨氧化古菌群落结构具有一定的影响。同理，氨氧化细菌的群落结构受施肥措施的影响差异显著，尤其是ST处理下10~40 cm土层的分化对AOB群落结构的影响更甚。
4 结论长期施肥如秸秆有机肥、有机-无机肥和全量化肥处理显著提高稻田0~40 cm土层碱解氮、有效磷、土壤有机碳和全氮的含量及土壤硝化势，降低土壤pH，其中全量化肥处理在耕作层（0~20 cm）土壤中对土壤酸化的影响更大。长期不施肥稻田土壤AOB是氨氧化作用的主要驱动者，长期施肥使稻田土壤酸化、促进AOA的生长，表明AOA在硝化过程中具有潜在作用。三种施肥处理均显著富集AOA的Nitrosocosmicus和AOB的Nitrosolobus。有效磷和pH分别为驱动土壤AOA和AOB群落结构演替的核心因子，施肥措施和土层分化均对AOA、AOB群落结构具有显著影响。
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