2022, Vol. 59
表1(Table 1)
甲烷(CH4)是仅次于二氧化碳(CO2)的长寿命温室气体，对全球温室效应的贡献率约为17%。甲烷在100年尺度的全球增温潜势是等质量CO2的28倍[1-3]。自工业革命以来，大气中甲烷浓度增加了150%，其排放量仍以每年1.0%的速度在递增[4]。稻田是重要的甲烷排放源之一，其每年甲烷排放量约占全球排放总量的10%~20%[5]。微生物介导的甲烷好氧氧化被认为是控制稻田甲烷排放的重要途径，可氧化产甲烷菌产生的40%~90%的甲烷[6-7]。
根据细胞结构和功能及系统进化发育关系，甲烷氧化菌可分为三大类[8]。第一类包括I型和X型甲烷氧化菌，属于γ变形菌纲，主要有甲基杆菌(Methylobacter)、甲基球菌(Methylococcus)、甲基单胞菌(Methylomonas)、甲基微菌(Methylomicrobium)和甲基八叠球菌(Methylosarcina)等10个属。第二类为II型甲烷氧化菌，属于α变形菌纲，主要包括甲基弯曲菌(Methylosinus)和甲基包囊菌(Methylocystis)等5个属。第三类甲烷氧化菌属于疣微菌门(Verrucomicrobia)，主要由嗜热嗜酸菌组成[9]。有研究发现，稻田土壤中甲烷氧化菌的主要类型是II型菌[10-11]。但也有研究表明，I型菌主要分布在水稻的根际和水土交界面的表层土壤中，而II型菌则更适应低氧环境[12]，其在下层缺氧区占优势地位[13]。
CO2作为最重要的温室气体，对气候变暖的贡献最大。气候模型预测表明，至21世纪末大气中CO2浓度可能会翻一番[14]。大气CO2浓度升高会极大地影响陆地生态系统的性质和功能[15]。在水稻不同生长期，土壤环境因子会发生改变，并与大气CO2协同作用后对土壤甲烷氧化过程产生影响。土壤中的CO2浓度是大气中的10倍~15倍，因此大气CO2浓度升高几百μL·L-1很难直接改变土壤微生物群落结构[16]。但有证据表明，高浓度的CO2能够促进植物生长发育，并通过增加植物向土壤的碳输入以及改变其他相关土壤理化性质(如氮素水平、氧气含量)等影响土壤微生物群落结构和活性[17-19]。可见，大气CO2浓度升高可能会对稻田甲烷氧化菌的活性、丰度和群落结构产生间接影响，进而改变稻田甲烷排放量。有研究表明，较高的大气CO2浓度会使土壤中甲烷的氧化量减少，进一步加剧气候变化[20-22]。然而也有研究发现，大气CO2浓度升高能够促进稻田土壤甲烷氧化菌的生长[16, 23-24]。因此，当前关于大气CO2浓度升高对稻田甲烷氧化过程的影响结论仍存在争议，其影响机理尚不明确。
大气CO2浓度是长时间缓慢增加的过程，而不是短期内增至某一浓度后固定不变。目前尚少见CO2浓度缓增对土壤甲烷氧化菌影响的相关研究。本研究在背景CO2浓度基础上设置了CO2浓度缓增处理，更加真实地模拟大气CO2浓度升高的情境。此外，高通量测序方法(如Illumina MiSeq)在研究土壤微生物群落中更具有优势，能够对微生物群落特征提供更全面的解释[25-26]。然而该方法较少应用于研究稻田土壤甲烷氧化菌群落的动态变化。本研究采用Illumina MiSeq测序技术以及定量PCR等手段，从基因、群落、活性等多个层次上解析CO2浓度缓增对稻田土壤甲烷好氧氧化过程的影响及其作用机理。
1 材料与方法 1.1 试验区概况试验区设置在江苏省农业气象重点实验室的稻田试验地(32.16 °N，118.86 °E)，属亚热带湿润气候区，年平均降水量1 100 mm，多年平均气温15.6 ℃。供试土壤为潴育型水稻土，灰马肝土属，耕层土壤质地为壤质黏土。供试水稻品种为南粳9108，全生育期为149~153 d。稻田土壤的氮肥年施用量为250 kg·hm-2。水分管理方式为生育前期淹水、中期烤田、后期干湿交替。
1.2 土壤样品采集与分析本研究依托于开顶气室(Open Top Chambers，OTC)组成的CO2浓度升高自动调控平台，该平台于2016年建成并运行，包括OTC、CO2传感器、自动控制系统及通气装置。每个OTC内配置CO2传感器(GMM222传感器，芬兰)及温湿度自动记录仪。通过计算机程序实现OTC内CO2浓度的自动监测和调节，以确保OTC内CO2浓度维持在目标浓度值。CO2气源为高纯CO2钢瓶，利用汇流盘连接24个钢瓶集中供气。
以大气CO2浓度为对照(Ambient CO2，AC)，设置CO2浓度缓增处理(Elevated CO2，EC)，每个处理各3个重复。EC处理为在背景CO2浓度基础上，自2016年起每年增加40 μL·L-1。于2019年采集水稻4个关键生育期即：分蘖期、拔节期、扬花期和乳熟期0~5 cm的根际土壤。该年EC处理的CO2浓度为AC+160 μL·L-1。采用烘干法测定土壤含水率；以玻璃电极法测定土壤pH；以比色法测定土壤无机氮(NH4+-N、NO2--N和NO3--N)[27]；土壤有机质含量的测定方法参考《土壤农化分析》[28]。
1.3 甲烷氧化潜势测定取约3 g新鲜土样置于12 mL玻璃瓶(Labco，英国)中，并向瓶内加入5 mL去离子水后，用橡胶塞密封。随后，用纯甲烷进行等体积置换，使甲烷含量占比约10%(体积比)。将玻璃瓶置于摇床以35 ℃，120 r·min-1震荡培养。期间，每隔12 h用50% ZnCl2溶液终止一批反应，直至最后一批样品于第72 h培养结束。用气相色谱仪(Agilent 7890B，美国)测定玻璃瓶中顶空甲烷浓度。最后，根据甲烷浓度随时间减少进行线性拟合，计算甲烷氧化潜势。
1.4 DNA提取和PCR扩增根据Power Soil DNA Isolation kit试剂盒(MoBio，美国)说明书对不同处理下稻田土壤样品的总DNA进行抽提。DNA浓度和纯度利用超微量分光光度计(NanoDrop2000，美国)进行测定，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。利用特异性引物A189F(5'-GGNGACTGGGACTTC TGG-3')和mb661R(5'-CCGGMGCAACGTCYTTAC C-3')[17]对甲烷氧化菌pmoA基因进行PCR扩增。扩增程序如下：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后以72 ℃延伸10 min。PCR反应体系为20 μL：4 μL 5×astPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol·L-1 dNTPs，0.8 μL正向引物(5 μmol·L-1)，0.8 μL反向引物(5 μmol·L-1)，0.4 μL FastPfu聚合酶，0.2 μL BSA(牛血清蛋白)，以及10 ng DNA模板。
1.5 Illumina Miseq测序利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences，USA)进行PCR产物纯化；利用QuantiFluor™-ST(Promega，USA)进行产物检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina，USA)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库(上海美吉生物医药科技有限公司)。
1.6 序列分析原始序列使用Trimmomatic软件质控，以FLASH软件进行拼接，具体步骤如下：(1)设置50 bp的窗口，若窗口内的平均质量值低于20，从窗口前端位置截去该碱基后端所有序列，之后再去除质控后长度低于50 bp的序列；(2)根据重叠碱基overlap将两端序列进行拼接(最大错配率为0.2，长度需大于10 bp)；(3)根据序列首尾两端的barcode和引物将序列拆分至每个样本并精确匹配。使用UPARSE软件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)以86%的相似度对序列进行OTU聚类[29]，同时去除单序列和嵌合体。最终通过对比pmoA数据库，利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)对每条序列进行物种分类注释。甲烷氧化菌的pmoA基因序列已上传至美国国家生物技术信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)，序列登录号为PRJNA612131。
1.7 定量PCR使用特异性引物A189F和mb661R，通过定量PCR(quantitative PCR，qPCR)测定甲烷氧化菌pmoA基因的丰度(PCR反应体系和反应条件参见1.4部分)。利用质粒标准样品稀释7个浓度梯度，绘制标准曲线。根据标准曲线得到每个样品的pmoA基因拷贝数(每个样品3个重复)。
1.8 数据处理采用美吉生物云平台对测序数据进行分析。使用SPSS 25.0软件的t检验分析不同处理间各指标(甲烷氧化活性、甲烷氧化菌数量、多样性等)的差异及其显著性。使用SPSS 25.0软件对各理化指标和微生物指标之间的关系进行Pearson相关性分析。
2 结果 2.1 大气CO2浓度缓增对稻田土壤理化因子的影响不同CO2浓度处理下各生育期稻田土壤的理化性质见表 1。结果显示，在不同CO2浓度处理下，四个关键生育期的土壤含水率和pH在较小的范围内波动。在分蘖期，AC和EC处理下土壤中DOC含量未见明显变化，但EC处理下土壤中NH4+-N、NO2--N和NO3--N含量均显著低于AC处理。在拔节期，EC处理的NO2--N含量显著高于(P < 0.05)AC处理，而其他土壤理化因子未见有显著变化。在扬花期，与AC相比，EC处理的土壤有机碳与DOC含量显著提高(P < 0.05)，但NH4+-N和NO2--N含量显著降低(P < 0.05)。在乳熟期，EC处理下土壤中DOC含量较AC有所增加，但未达到显著性水平。
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表 1 不同CO2浓度处理下各生育期稻田土壤的理化性质 Table 1 Physiochemical properties of paddy soils during different rice growth stages under different CO2 treatments |
土壤泥浆培养试验结果显示，该稻田土壤的甲烷氧化潜势在分蘖期达到最高值，并随着水稻的生长，甲烷氧化潜势呈下降趋势(图 1a)。除分蘖期外，EC处理促进了土壤甲烷氧化潜势，且在拔节期和乳熟期达到显著性水平(P < 0.05)。分蘖期的土壤甲烷氧化潜势随CO2浓度的升高显著降低(P < 0.05)。综合每个生育期的数据，EC处理使得稻田整体甲烷氧化潜势增加11.7%。
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图 1 不同CO2浓度处理下各生育期稻田土壤的甲烷氧化潜势(a)及甲烷氧化菌pmoA基因丰度(b) Fig. 1 Potential activity(a)and pmoA gene abundance(b)of methanotrophs in paddy soils during different rice growth stages under different CO2 treatments |
甲烷氧化菌pmoA基因的定量结果显示，AC处理在拔节期达到峰值，而EC处理在扬花期和乳熟期达到峰值(图 1b)。在乳熟期，甲烷氧化菌丰度随大气CO2浓度升高显著增加(P < 0.05)。这与同时期不同CO2处理下甲烷氧化潜势的变化趋势一致。相较于AC处理，EC处理下扬花期的pmoA基因丰度增加了79.0%；乳熟期的丰度增幅则高达348.2%。在分蘖期和拔节期，EC处理降低了甲烷氧化菌的丰度，分别低于AC处理的21.7%和2.6%，但均未达到显著性水平。综合每个生育期的数据，EC处理的甲烷氧化菌丰度高于AC处理的53%。
2.3 大气CO2浓度缓增对稻田土壤甲烷氧化菌pmoA基因多样性的影响利用OTU水平上的Sobs指数、香农指数和Chao 1指数，评估不同CO2浓度处理下土壤中甲烷氧化菌丰富度和多样性的变化。数据分析结果显示，单个样品中OTU数介于40~189之间。所有样品OTU的稀释曲线均接近饱和状态，表明本研究的测序深度足以描述甲烷氧化菌pmoA基因的多样性。研究发现，各时期的甲烷氧化菌pmoA基因多样性随大气CO2浓度升高呈降低趋势。其中在乳熟期，EC处理下土壤中甲烷氧化菌的多样性显著低于(P < 0.05)AC处理。但在其他三个生育期，不同处理下土壤中pmoA基因多样性差异不显著(图 2)。
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图 2 不同CO2浓度处理下各生育期稻田土壤中pmoA基因的Sobs指数(a)和香农指数(b) Fig. 2 The Sobs index(a)and Shannon index(b)of pmoA genes in paddy soils during different rice growth stages under different CO2 treatments |
以属为水平对不同CO2浓度处理下稻田土壤中甲烷氧化菌的群落组成进行分析。结果发现已知菌属主要包括I型的甲基八叠球菌(Methylosarcina)、甲基单胞菌(Methylomonas)、甲基球菌(Methylococcus)、甲基杆菌(Methylobacter)和II型的甲基包囊菌(Methylocystis)(图 3)。在AC处理下，土壤中I型甲烷氧化菌占比37.23%，II型菌占比39.95%；在EC处理下，I型占比50.2%，高于占比30.43%的II型菌。因此，大气CO2浓度升高改变了甲烷氧化菌的优势菌群，使得II型菌占比明显提高。甲基包囊菌属、甲基八叠球菌属和甲基单胞菌属始终是该稻田土壤中的优势菌属。在AC处理下，土壤中这三类优势甲烷氧化菌属的相对丰度分别为39.95%、17.86%和8.69%；而在EC处理下，这三种菌属的相对丰度则分别为30.43%、20.62%和18.77%。此外，土壤中还存在甲基球菌和甲基杆菌，以及其他未被分类的菌属，但其相对丰度较低(图 3)。
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注：TAC，分蘖期AC处理；TEC，分蘖期EC处理；JAC，拔节期AC处理；JEC，拔节期EC处理；FAC，扬花期AC处理；FEC，扬花期EC处理；MAC，乳熟期AC处理；MEC，乳熟期EC处理。 Note: TAC, AC treatment at the tillering stage; TEC, EC treatment at the tillering stage; JAC, AC treatment at the jointing stage; JEC, EC treatment at the jointing stage; FAC, AC treatment at the flowering stage; FEC, EC treatment at the flowering stage; MAC, AC treatment at the milky stage; MEC, EC treatment at the milky stage. 图 3 不同CO2浓度处理下各生育期稻田土壤甲烷氧化菌的群落组成 Fig. 3 Community composition of methanotrophs in paddy soils during different rice growth stages under different CO2 treatments |
对不同CO2处理下土壤中甲烷氧化菌群落组成进行组间差异显著性检验(图 4 a)，发现某些环境序列和未被分类的菌属的相对丰度存在显著性差异(P < 0.05)。但在乳熟期，EC处理下使得甲基单胞菌的相对丰度显著高于(P < 0.05)AC处理，而甲基包囊菌的相对丰度则显著低于(P < 0.05)AC处理(图 4b)。总体而言，甲烷氧化菌群落在两种CO2浓度处理间，存在显著差异(图 5，P = 0.039)。
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*，P < 0.05；**，P < 0.001 图 4 不同CO2浓度处理下稻田土壤中甲烷氧化菌在属水平上的总体群落结构差异(a)以及在和乳熟期的群落结构差异(b) Fig. 4 Variation of methanotrophic community composition at genus level in paddy soils during rice growth period(a)and at milky stage(b)under different CO2 treatments |
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图 5 不同CO2浓度处理下稻田土壤中甲烷氧化菌群落结构与环境因子关系的RDA图 Fig. 5 Redundancy analysis(RDA)ordination plots showing the relationship between the community structures of methanotrophs and environmental factors in paddy soils under different CO2 treatments |
RDA结果显示，土壤pH和NO2--N含量对甲烷氧化菌的群落结构有显著影响(P < 0.05)(图 5)。不同CO2浓度处理下土壤的甲烷氧化潜势和pmoA基因丰度与DOC含量、NH4+-N含量呈正相关，而甲烷氧化潜势又与pH呈负相关，但均未达到显著性水平(表 2)。本研究未发现单一的环境因子对甲烷氧化潜势和pmoA基因丰度、多样性的变化有显著影响。此外，甲烷氧化潜势和pmoA基因多样性存在显著正相关(P < 0.05)。
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表 2 不同CO2浓度处理下稻田土壤的甲烷氧化潜势及pmoA基因丰度、多样性与环境因子的相关性 Table 2 Potential correlations between the potential activity of methanotrophs, pmoA gene diversity and abundance and different environmental factors in paddy soils under different CO2 treatments |
甲烷是甲烷氧化菌唯一的碳源和能源。据报道，土壤中甲烷浓度是影响稻田甲烷氧化潜势和甲烷氧化菌群落的重要因素。大量研究表明，土壤中甲烷氧化速率随甲烷浓度的升高而增加[30-32]。大气CO2浓度升高会促进稻田中甲烷的产生量[33-34, 35-36]。这主要是由于CO2浓度升高刺激了水稻的生长发育，增加了其根系生物量和分泌物[37-38]，导致向土壤中释放更多的含碳物质。这给产甲烷菌提供了更多的底物来源[36]。本研究发现，大气CO2浓度缓增增加了某些生长期稻田根际土壤甲烷氧化菌的丰度以及甲烷氧化潜势(图 1)。相关性分析显示，甲烷氧化潜势和pmoA基因丰度均与DOC含量呈正相关关系(表 2)。这说明大气CO2浓度升高间接导致土壤DOC含量增加，使产甲烷潜势增强，进而给甲烷氧化菌提供了更多底物甲烷来源。土壤中相对较高浓度的甲烷有利于甲烷氧化潜势和甲烷氧化菌丰度的增加。
与此同时，氧气的可获得性是甲烷氧化的重要限制因子[39]。大气CO2浓度升高可使水稻根系的通气组织愈加发达，继而增加大气向水稻根际O2的输送。这在一定程度上可以提高水稻根际的甲烷氧化潜势。早期，王义琴等[40]利用微根窗技术对植物进行观测，发现在大气CO2浓度倍增条件下，植物的根长和根数量与自然环境生长的植物相比，分别增加了16%和34%。本研究结果发现，在扬花期和乳熟期的土壤中，甲烷氧化菌丰度与同时期的甲烷氧化潜势呈相同的变化趋势：均随大气CO2浓度的升高而显著增加(P < 0.05)(图 1)。该结果很可能是由于在水稻生长的中后期，大气CO2浓度升高下水稻根系生长更加发达，使得根际区域O2含量增加，从而刺激了甲烷氧化菌的生长与活性。先前的相关研究也发现，大气CO2浓度升高会促进稻田土壤甲烷氧化菌活性及其pmoA基因丰度的增加[16, 24, 41]。然而也有研究发现，大气CO2浓度升高会增强叶片的水分利用效率，使得土壤水分增加，进而通过影响土壤中O2扩散速率抑制甲烷氧化活性[20, 34, 42]。但这种情况多发生于森林、草地等生态系统中。稻田土壤长时间处于淹水条件，水分较为充足。大气CO2浓度升高所引起的土壤含水量的微小增加，可能不足以改变稻田中的气体扩散速率。本研究中稻田表层土壤的含水率较高，且并未随CO2浓度升高发生明显改变(表 1)。
氮素含量是影响稻田甲烷氧化的另一重要环境因子。本研究发现，大气CO2浓度升高导致了土壤中
随着大气CO2浓度的升高，甲烷氧化菌的优势菌群发生了改变：从II型菌(相对丰度为39.95%)转变为I型菌属(相对丰度为50.2%)。因此，大气CO2浓度升高促使了土壤中II型菌向I型菌的演替。AC处理的优势菌属为甲基包囊菌(II型)、甲基八叠球菌和甲基单胞菌(均为I型)(图 3)。这与先前稻田土壤中甲烷氧化菌的主要类型是II型菌的结果一致[10，53-54]。据报道，甲基弯曲菌和甲基包囊菌(均为II型)的相对丰度会随大气CO2浓度升高而降低[32]。研究表明，在高
大气CO2浓度缓增促进了稻田土壤甲烷氧化潜势的增加，以及甲烷氧化菌的生长。同时，大气CO2浓度升高显著改变了土壤中甲烷氧化菌的群落结构，使得优势菌属由起初的II型菌转变为I型菌。大气CO2浓度升高会促进作物的生长，导致稻田土壤中甲烷浓度和根际环境通气性的增加，并调节土壤中的氮素水平。以上多个环境因子的综合作用很可能是稻田甲烷氧化潜势、甲烷氧化菌丰度与群落结构发生改变的重要原因。
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