2022, Vol. 59
2. 贵州省烟草公司遵义市公司，贵州遵义 563000
2. Zunyi Company of Guizhou Tobacco Company, Zunyi, Guizhou 563000, China
在贵州省黔北地区，旱地以种植玉米和烤烟为主，因烤烟经济价值高于玉米，导致烤烟连作较普遍，长期连作引起生产力下降，而轮作是缓解连作障碍，提高经济和生态效益的重要方法[1-2]。在当地，劳动力缺乏，以单施化肥为主。大量研究表明，化肥有机肥配施是解决农田可持续发展的重要手段[3-4]。磷是植物生长的必需元素之一。土壤中的磷以无机和有机形式存在，前者一般占土壤全磷的60%~80%，后者占20%~40%[5]。由于钙、镁、铁、铝的固定作用，土壤溶液中的磷和施入土壤的磷肥迅速与之结合，形成难溶性磷酸盐，有效性降低，磷肥利用率一般不足30%[6]。为了满足作物的磷素营养和高产优质的需要，过量施用磷肥的现象十分普遍，由此产生了一系列如肥料浪费、环境污染和土壤磷积累等生产和环境问题。因此，以黔北地区主要种植和施肥模式为对象，利用长期定位试验，研究土壤磷的转化供应及其机制，有益于挖掘土壤供磷潜力，提高磷肥利用率，减施磷肥。
微生物是土壤的重要成分，参与土壤有机质循环、养分转化和毒物降解等生物化学过程[7]。其中，活化磷的微生物（phosphorus-mobilizing microbes，PMM）能溶解难溶性无机磷和矿化有机磷，提高土壤磷的有效性和磷肥利用率。在溶解无机磷的微生物中，分泌氢离子和有机酸（如甲酸、草酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸和葡萄糖酸等）起重要作用[8-9]；目前，人们普遍采用分离培养技术研究土壤PMM的种群、数量和功能。但是，分离培养技术仅能获得1%~3%的土壤微生物[10]，不能全面真实反应土壤PMM的种类、数量、多样性及其功能。此外，土壤中的微生物互相影响和互相作用，PMM活化磷是在多种微生物共存的条件下进行的，单独进行的分离培养难以反映PMM活化磷的实际情况。相对而言，利用不同难溶性无机磷（如Ca3（PO4）2、FePO4和AlPO4等）做磷源，研究土壤悬浊液的溶磷作用，可能更加真实地反映多种微生物共同存在的条件下，PMM活化磷的特征[11]。为此，本项研究利用15年的长期种植施肥的土壤，制备土壤悬浊液，研究了土壤微生物对磷的活化作用，并结合磷活化功能基因的丰度分析，揭示了合理轮作和科学施肥提高土壤磷的有效性和磷肥利用率的机理，为改善土壤功能和减肥增效提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验地概况土壤肥力肥效长期定位监测基地位于贵州省遵义市烟草公司三岔镇科技园（27°32′2′′N，106°56′32′′E，海拔885 m）。当地天然植被为常绿亚热带阔叶林，年均气温15.5℃，年均降水1 100 mm，年均蒸发量550 mm。试验始于2004年春，土壤类型为石灰岩发育的黄壤，2019年土壤理化性质见表 1。
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表 1 土壤理化性质（2019年） Table 1 Soil physicochemical properties in 2019 |
试验处理包括：（1）撂荒地（CK），（2）烤烟连作—单施化肥（C-CF），（3）烤烟连作—化肥有机肥配施（C-CFM），（4）烤烟玉米轮作—单施化肥（R-CF），（5）烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施（R- CFM）。玉米施用N 120 kg·hm-2、P2O5 90 kg·hm-2、K2O 90 kg·hm-2，烤烟施用N 100 kg hm-2、P2O5 50 kg hm-2和K2O 200 kg hm-2；由烤烟专用复合肥、尿素、过磷酸钙和硫酸钾提供；有机肥为遵义市烟草公司提供的专用有机肥（N 2%、P2O5 1%和K2O 1%）。在化肥有机肥配施的处理中，养分含量以氮计，化学氮和有机氮各50%，不足的磷钾由过磷酸钙和硫酸钾补充，使各处理的NPK用量相等。试验采用随机完全区组设计，各处理重复三次，小区面积20 m2（4 m × 5 m）。奇数年全部种植烤烟，偶数年烤烟-玉米轮作，供试烤烟品种K326，供试玉米品种筑黄3号，行株距均为0.8 m×0.7 m，种植管理同当地大田生产。
1.2 试验方法在晴朗多日后，各小区随机选取9株植株，用抖根法采集根际土壤，混合均匀，分为两份。一份50 g土样-80℃保存，送上海美吉生物科技有限公司进行16S rRNA和18S rRNA基因测序和数据处理。具体方法是：用E.Z.N.A.® Soil Kit试剂盒提取土壤总DNA，经纯化和检测等预处理后，以338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）为引物，PCR扩增16S rDNA的V3~V4高变区，再经回收定量，利用Illumina高通量测序平台进行测序，去除测序得到的原始数据中可能存在的PCR扩增与测序错误，得到优化序列，按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行聚类，在聚类过程中去除嵌合体，将所有优化序列映射至操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）代表序列，形成OTU。最后，利用Mothur软件计算土壤细菌的查欧（Chao）丰富度指数、希普（Heip）均匀度指数、香农（Shannon）多样性指数和辛普森（Simpson）优势度指数；通过每个OTU对应的Greengene ID，获得OTU对应的COG家族信息和KEGG Orthology（KO）信息，根据该信息可以从EggNOG数据库中解析到各个COG的描述信息，以及其功能信息，计算得到微生物活化土壤无机磷的相关通路的丰度。
将另一份250 g土样磨细过0.5 mm筛，制备出土壤悬浊液（土：无菌水=1：100），再用无菌水稀释至10-5。取200 μL稀释液，分别接种于由Ca3（PO4）2、FePO4和AlPO4（以下简称钙磷、铁磷和铝磷）为磷源的NBRIP（National Botanical Research Institute Phosphate growth medium）固体培养基[12]。30℃培养2 d，观察出现溶磷圈的菌落数。用牛肉膏蛋白胨培养基，马铃薯-糖培养基和高氏培养基分别对土壤细菌、真菌和放线菌进行计数[13]。另取200 μL 1：100的土壤悬浊液，分别接种于50 mL由钙磷、铁磷和铝磷为磷源的NBRIP液体培养基（初始pH调节为7.00，有效磷含量为0，合称混合培养液，分别简称钙磷混合液、铁磷混合液和铝磷混合液，下同），培养6 d（30 ºC、160 r·min-1）。分别在接种后12、24、48、72、96、120和144 h，吸取培养液，5 000 r·min-1离心10 min，测定pH（电位法）和上清液中可溶性无机磷含量（钼锑抗比色法）[14]。在培养结束后，用高效液相色谱仪（HITACHI Co.，Ltd，Tokyo，日本）测定上清液有机酸含量[15]。色谱条件为色谱柱：Ion-300有机酸分析专用柱（Phenomenex，Torrance，CA，美国），进样量：20 μL，流动相：2.5 mmol·L-1硫酸，流速：1.0 mL·min-1，柱温：35 ℃，压力450 psi（1 psi=6.895 kPa），检测器：Diode Array L-7455紫外检测器，检测波长：210 nm。检测的有机酸包括柠檬酸、葡萄糖酸、丁二酸、乳酸、甲酸、乙酸和苹果酸，其出峰时间依次为13.70、15.40、16.62、18.63、20.80、21.69和22.90 min。
1.3 数据处理采用SPSS 19.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA），邓肯（Duncan）法比较处理间的差异显著性，Excel 2016软件进行基本计算和作图。
2 结果 2.1 不同处理土壤中的可培养微生物在不同处理的土壤中，微生物种群存在显著差异（表 2），表现为：（1）与单施化肥相比，化肥有机肥配施显著降低真菌数量，但增加土壤可培养微生物（细菌、真菌和放线菌之和，下同）、细菌、放线菌、溶磷微生物（包括溶解钙磷、铁磷和铝磷的微生物，下同）数量；（2）与烤烟连作相比，在烤烟玉米轮作的土壤中，可培养微生物、细菌、放线菌、真菌和溶磷微生物数量的变化趋势类似化肥有机肥配施（与部分处理间的差异未达显著水平）；（3）在烤烟连作-单施化肥的处理中，真菌最多（与烤烟玉米轮作—单施化肥处理间的差异未达显著水平），可培养微生物、细菌、放线菌和溶磷微生物最少；（4）在烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施的土壤中，可培养微生物、细菌、真菌、放线菌和溶磷微生物的数量与烤烟连作—单施化肥的处理相反（与部分处理间的差异未达显著水平）。
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表 2 土壤可培养微生物数量 Table 2 Number of culturable soil microorganisms(mean±SD, n=3) |
高通量测序检测出细菌16S rRNA基因30 802~43 244片段，真菌18S rRNA基因30 228~40 020片段。据此计算的细菌群落特征值（表 3）表明，各处理土壤的查欧丰富度指数无显著差异，变化于1 691~1 751；希普均匀度指数烤烟连作—单施化肥和撂荒地（0.36~0.38）显著低于烤烟玉米轮作和烤烟连作—化肥有机肥配施（0.42~0.44）；香农多样性指数烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施最高，烤烟连作—单施化肥最低；辛普森优势度指数烤烟连作—单施化肥最高，烤烟玉米轮作和烤烟连作—化肥有机肥配施最低。真菌群落特征值查欧丰富度指数无显著差异；希普均匀度指数由高到低依次为：撂荒地（0.21）、单施化肥处理（0.16）、化肥有机肥配施（0.11~0.12）；香农多样性指数撂荒地最高，烤烟连作—化肥有机肥配施最低；辛普森优势度指数化肥有机肥配施最高（0.10~0.12），撂荒地最低（0.05）。
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表 3 土壤微生物的群落特征 Table 3 Community characteristics of soil microorganisms |
图 1是培养期间各混合培养液的有效磷变化。在土壤悬浊液+钙磷培养液（简称钙磷混合液，下同）中，有效磷变化呈单峰曲线，峰值以烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施者最高，烤烟连作—单施化肥者最低；培养结束时各钙磷混合培养液中的有效磷无显著差异。在土壤悬浊液+铁磷培养液或铝磷培养液（简称铁磷或铝磷混合液，下同）中，有效磷随培养时间延长而上升，但铝磷混合液的升速和升幅大于铁磷混合液；培养结束时，各混合液中的有效磷高低顺序同钙磷混合液峰值时的变化。
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注：CK0：液体培养基，下同。 Note: CK0:liquid culture medium, the same below. 图 1 混合液有效磷的变化 Fig. 1 Changes of available P in the mixture of soil suspension and culture solution |
此外，在钙磷混合液中，有效磷峰值为120.5~166.4 mg·L-1，培养结束时变化于1.69~4.42 mg·L-1；在铁磷和铝磷混合液中，培养结束时分别变化于16.02~24.29 mg·L-1和48.11~65.54 mg·L-1。
2.4 混合液中的pH和有机酸的变化图 2是土壤悬浊液+不同磷源的培养液（简称不同磷源的混合液）的pH变化。其中，各处理钙磷混合液的pH先迅速降低，降至最低值后升高，不接种者无显著变化，各钙磷混合液之间的pH最终无显著差异；各处理铁磷混合液的pH持续降低，培养早期降速快，后期降速慢，不接种降幅最小，烤烟连作—单施化肥者降幅次之，烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施土壤的铁磷混合液降幅最大；铝磷混合液的pH变化类似铁磷混合液，但前期pH下降更快，培养48 h后几乎无显著变化。
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图 2 混合液pH的变化 Fig. 2 pH changes in the mixture of soil suspension and culture solution |
此外，钙磷混合液的最低pH变化于4.37~4.81，显著高于铁磷和铝磷混合液的最低pH（1.76~2.44）。
在各混合液中，均检测到柠檬酸和乙酸；在钙磷混合液中能检测到丁二酸和甲酸；在钙磷、铁磷和铝磷混合液中能检测到葡萄糖酸、苹果酸、丁二酸、乳酸和甲酸（表 4）。就总有机酸而言，钙磷混合液、烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施和撂荒地制备的铁磷和铝磷混合液的含量最高，且无显著差异；烤烟连作—单施化肥的土壤悬浊液和铁铝磷制备的混合液最低。
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表 4 不同混合液中有机酸含量 Table 4 Concentration of organic acids in mixture of soil suspension and culture solution/(mg·mL-1, mean±SD, n=3) |
相关分析（表 5）表明，在三种不同的混合液中，有效磷均与柠檬酸呈显著或极显著正相关（r = 0.575~0.862，n = 15，P < 0.05或0.01）；在铁磷和铝磷混合液中，有效磷与总有机酸（r = 0.886~0973，n = 15，P < 0.01）呈极显著正相关，其中，有效磷与乳酸、甲酸和乙酸呈显著或极显著正相关（r = 0.629~0.951，n = 15，P < 0.05或0.01）；但仅在铝磷混合液中，有效磷与苹果酸呈极显著正相关（r =0.983，n = 15，P < 0.01）。
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表 5 混合液中有效磷与有机酸间的相关性 Table 5 Correlation analysis of available P and organic acids in mixture of soil suspension and culture solution |
由图 3可知，5种处理的柠檬酸（Si）合酶、蛋白葡萄糖脱氢酶和苹果酸合酶合成通路的相对丰度由高到低依次为：R-CFM、R-CF、CK、C-CFM、C-CF，烤烟玉米轮作处理、撂荒地处理、烤烟连作处理。
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注：图中不同小写字母表示同种酶不同处理间差异显著（P < 0.05）。 Note: Different lowercases indicate significantly difference(P < 0.05)between different treatments. 图 3 柠檬酸（Si）合酶、蛋白葡萄糖脱氢酶和苹果酸合酶合成通路的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of synthesis pathways of citric acid(Si)synthase, protein glucose dehydrogenase and malate synthase |
一般而言，土壤微生物的数量较多，说明土壤生态环境良好，适宜它们生长繁殖；微生物群落的多样性指数高，意味着微生物种群丰富，多种微生物共存；优势度指数低，表明单一微生物尤其是病原微生物不能过度繁殖[16]。因此，在肥沃健康的土壤中，微生物数量较多，种群比较丰富[17]。在烤烟玉米轮作、化肥有机肥配施和撂荒地处理的土壤悬浊液中，可培养微生物、细菌和放线菌分别高于烤烟连作和单施化肥的处理（表 2），说明轮作、施用有机肥和休闲改善了生态环境，提供了丰富多样的营养物质，有益于上述微生物生长繁殖，数量增加，种群增多，与前人研究[18-19]类似。其中，在烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施的土壤中，可培养微生物、细菌和放线菌最多，土壤微生物群落特征值总体较优。因此，就土壤微生物的角度而言，合理种植和科学施肥对于培肥土壤较休耕的效果更好，在遵义烟区提倡烤烟玉米轮作和有机无机配施，能将粮食生产和经济效益充分结合，比较适宜当地人多地少的实际情况。
3.2 土壤悬浊液对无机磷的溶磷作用将土壤用纯水按比例稀释后得到土壤悬浊液。与原土相比，土壤悬浊液中的微生物数量应呈比例减少，但其组成与土壤相似，研究土壤悬浊液对无机磷的溶解作用可大体反映原土壤微生物活化无机磷的总体状况。在培养过程中，钙磷混合液的有效磷峰值为铁磷和铝磷混合液的2.51倍~7.52倍（图 1），说明供试土壤微生物活化钙磷的能力可能大于铁磷和铝磷。在分别供给三种无机磷源的条件下，混合培养液有效磷的峰值以烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施者最高，烤烟连作—单施化肥者最低（图 1），意味着长期实施烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施可能提高了土壤微生物活化无机磷的能力，有益于土壤磷素供应和提高磷肥利用率；长期烤烟连作—单施化肥则相反，土壤供磷和磷肥利用率降低。
在溶磷微生物的纯培养中，以有效磷的变化来指示溶磷能力[20-21]。在本试验中，土壤悬浊液在钙磷、铁磷和铝磷这三种混合培养液中，有效磷的变化类似于微生物纯培养[22]。混合培养液的有效磷变化是微生物活化与利用、化学溶解与固定等综合作用结果。研究[9, 23]表明，多数溶磷微生物溶解钙磷的速率一般较快。在微生物培养过程中，微生物生长和代谢呈“S”曲线，导致混合液有效磷先迅速上升，丰富的有效磷同时也促进了微生物迅速生长繁殖；随着微生物生长速率降低和对有效磷的利用，导致混合培养液中有效磷降低。相反，微生物溶解铁磷和铝磷的速率较为缓慢[9, 24-25]。在培养过程中，土壤微生物尚未进入磷活化大于磷利用周期范围。但需要说明的是，微生物衰亡后，所释放的磷容易被植物吸收利用，故PMM（磷活化微生物）对磷的利用可视为有效磷的一种储备形式。所以，土壤悬浊液混合培养技术既能反映溶磷微生物的溶磷特征，又更接近土壤微生物菌群复杂的溶磷状况。
3.3 土壤悬浊液中复合微生物菌群溶解无机磷的机理在混合培养液中，pH的变化与有效磷浓度的变化相反（图 2），说明土壤微生物分泌H+参与无机磷溶解。但进一步分析发现，铁磷或铝磷混合培养液的pH最低值（1.76~2.44）和有效磷最大值（24.29~65.54 mg·L-1）远低于钙磷混合液（pH 4.37，166.4 mg·L-1），说明H+溶解铁磷和铝磷的作用小于对钙磷的溶解作用。相关分析表明，在铁磷和铝磷混合液中，有效磷与柠檬酸、苹果酸、丁二酸、乳酸、甲酸和有机酸总量呈显著正相关（r = 0.629~0983，n = 15，P ≤ 0.01）；在钙磷混合液中，钙磷混合培养液有机酸总量最高，仅柠檬酸与有效磷呈显著正相关（r = 0.575，n = 15，P ≤ 0.05），葡萄糖酸、苹果酸、丁二酸、乳酸、甲酸和有机酸总量与有效磷均无显著相关（表 5）。由此可见，在铁磷和铝磷活化过程中，有机酸起重要作用；在钙磷活化过程中，H+的作用可能更大，支持前人纯培养的结论[9, 26]。
微生物（16S rDNA和18S rDNA）扩增测序预测出，供试土壤微生物中存在柠檬酸（Si）合酶、蛋白葡萄糖脱氢酶和苹果酸合酶等的合成通路。柠檬酸（Si）合酶和苹果酸合酶直接关系到低分子量有机酸的合成，蛋白葡萄糖脱氢酶涉及葡萄糖代谢形成葡萄糖酸和H+分泌[9]。各通路的相对丰富度均以烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施最高，烤烟连作—单施化肥最低，烤烟玉米轮作优于烤烟连作，化肥有机肥配施和撂荒地显著高于单施化肥。由此，从分子生物学角度解释了合理轮作和化肥有机肥配施提高土壤供磷能力的原因。在本研究中，作物收获后各处理之间的土壤有效磷含量无显著差异（表 1），但轮作和化肥有机肥配施处理的玉米和烤烟产量增加，磷的吸收量提高[27]，说明在作物生长期，这些处理的土壤磷素供应水平是增加的。在施磷量不变的条件下，土壤磷素供应水平提高，意味着磷的活化增强，源于溶磷菌的相对丰度提高，由此进一步说明，利用土壤悬浊液的溶磷特征可能更加真实地反映多种微生物共存的条件下微生物活化无机磷的能力。
4 结论在接种了土壤悬浊液的混合培养液中，土壤悬浊液中的PMM释放有机酸，在降低pH的同时溶解不同磷源的难溶性磷，培养液中的有效磷含量表现为化肥有机肥配施和撂荒地高于单施化肥，烤烟玉米轮作高于烤烟连作，说明长期单施化肥和烤烟连作会破坏原有的土壤环境，降低土壤微生物群落的多样性，烤烟玉米轮作和化肥有机肥配施可促进PMM对土壤无机磷的活化，提高土壤磷的生物有效性。此外，土壤悬浊液混合培养液中的有效磷变化和溶磷机制与微生物纯培养相似，说明土壤悬浊液培养可以作为纯微生物液体培养的延伸，有效表征PMM对无机磷的活化能力。对土壤细菌进行功能预测，发现土壤中有机酸合成相关酶合成通路相对丰度均以烤烟玉米轮作—化肥有机肥配施最高，烤烟连作—单施化肥最低，由此从分子生物学角度解释了轮作和有机肥促进土壤PMM活化无机磷的原因。
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