2022, Vol. 59
表1(Table 1)
2. 绿色智能肥料创新农业农村部重点实验室, 南京思农生物有机肥研究院, 南京 210031
2. Key Laboratory of Green and Smart Fertilizer Innovation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing Sinong Bio-organic Fertilizer Institute, Nanjing 210031, China
长期过量施用化肥引发了一系列问题，如土壤板结与酸化、有机质含量下降、生物活性降低、果蔬品质变差等，为了促进农业的可持续发展，减少化肥施用量并配合有机替代成为扭转上述不利局面的重要措施[1]。生物有机肥是指畜禽粪便、农作物秸秆等废弃物经过腐熟堆肥处理后，与功能微生物复合而成的一类有机肥料[2]。生物有机肥能增加土壤肥力、净化和修复土壤，同时在促进植物生长、降低植物发病率、增加产量和提高作物品质等方面发挥重要作用[3]。
生物有机肥包括以下几种作用机理：（1）生物有机肥施入土壤后，肥料中的功能菌通过各种代谢活动提高土壤肥力。比如施用含固氮微生物的肥料，其中的固氮菌能通过特有的生物固氮作用将空气中不能被植株直接吸收利用的氮气还原为氨，再进一步转化为其他不同形态的氮后才能被植株吸收利用[4-7]；施用含解磷、解钾微生物的肥料，其中的微生物可将土壤中不能直接或者快速被植株吸收利用的不溶性或者有机类的养分，如磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁、有机磷等[8-9]分解转换为植株可直接吸收利用的养分。（2）生物有机肥中的功能菌能分泌生长素（吲哚乙酸，IAA）等生理活性物质促进植物生长[10]，同时当功能菌在植株根系繁殖形成优势种群时，也能抑制其他致病菌的生长繁殖，减少侵染作物根系的机会[11-12]。（3）生物有机肥中既含有N、P、K以及中量元素（Ca、Mg、S等）和微量元素（Fe、Mn、Cu等），供植物吸收利用，还含有氨基酸、蛋白质、糖、脂肪等有机成分[13]，这些成分能够帮助肥料中功能菌的定殖与功能发挥。定殖能力对功能微生物的应用潜力具有决定作用，功能菌如果不能定殖，其在应用中的可行性就会降低[14]。刘云鹏[15]研究发现山梨糖醇对解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp的定殖具有显著促进作用。碳源主要作用是供给菌种生命活动所需要的能量，构成菌体细胞成分，是菌体代谢中的主要碳素来源[16]，但是有机肥中微生物易利用的碳源是有限的。因此，笔者根据现有研究结果提出假说，向生物有机肥中加入功能菌SQR9-gfp偏好的碳源山梨醇，应能有效提高其定殖以及功能的发挥。鉴于此，本研究以含山梨醇和解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp的生物有机肥为研究对象，以试验作物生物性状、SQR9-gfp定殖数量和产IAA能力为关键指标，研究了该生物有机肥的促生效应与机理。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试功能微生物为江苏省固体废弃物资源化高技术研究重点实验室分离保存的具有防控土传病害和促进植物生长的根际促生解淀粉芽孢杆菌SQR9（Bacillus amyloliquefaciens SQR9），该菌株为黄瓜根际促生拮抗功能菌株（PGPR）[17]，寄存于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.5808。该菌株已利用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）进行标记，记为SQR9-gfp。该菌株在荧光显微镜下能发出明亮的绿色荧光，其生长速度和代谢特性与野生型基本相同[18]。
本研究选用的黄瓜品种为江蔬-露丰黄瓜。
LB（Luria-Bertani）培养基（1 L）：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉2 g，pH调至7.0。培养SQR9-gfp时在接种前添加终质量浓度为20 µg·mL–1的卡那霉素；马丁氏培养基：KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，0.1 g·L–1孟加拉红水溶液3.3 mL，2.3 %琼脂，121 ℃高压灭菌15 min[19]，使用前每100 mL培养基中加1 g·mL–1链霉素溶液0.3 mL。
供试土壤采自江苏宜兴，土壤基本理化性质如下：pH 7.24，有机质15.44 g·kg–1，全氮1.96 g·kg–1，全磷1.62 g·kg–1，全钾11.58 g·kg–1，有效磷21.26 mg·kg–1，速效钾86.53 mg·kg–1。
供试有机肥由甘肃丝路盛丰生物科技集团有限公司提供。将解淀粉孢杆菌SQR9-gfp接种至有机肥中配制生物有机肥，使肥料中含菌量达到2×108 CFU·g–1。
试验所用拟南芥（Arabidopsis thaliana）为哥伦比亚（Col-0）野生型和IAA不敏感突变型pin2，由山西农业大学徐进教授团队提供。
1.2 试验设计黄瓜盆栽试验设4个处理：普通有机肥（OF）、普通有机肥+SQR9-gfp（OF+SQR9-gfp）、普通有机肥+山梨醇（OF+S）和普通有机肥+ SQR9-gfp +山梨醇（OF+SQR9-gfp+S）。每个处理设置10个重复，每个盆钵装土3 kg，添加5%（肥料干物质量/土干物质量）制备好的生物有机肥与土拌匀作为基肥，选取长势一致的种苗移栽。山梨醇添加量为肥料干物质量的4%，随生物有机肥施入土壤中。
SQR9-gfp分泌IAA试验设7个处理：不添加山梨醇（CK）和添加山梨醇（1、5、10、15、20和25 mg·L–1），设计参照刘云鹏[15]的方法进行。将解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp接种于不同山梨醇梯度的Landy培养基中，使其终浓度为10 mL·L–1，22 ℃，90 r·min–1避光摇菌72 h。
拟南芥验证试验设8个处理：野生型、野生型+SQR9-gfp、野生型+山梨醇、野生型+SQR9-gfp+山梨醇、突变型、突变型+SQR9-gfp、突变型+山梨醇和突变型+SQR9-gfp+山梨醇。拟南芥种子表面消毒，具体过程如下：70%乙醇浸泡2 min，10 g·L–1 NaClO处理3 min，再用无菌水洗涤4次，拟南芥种子于1/2 MS（Murashige and Skoog）培养基4 ℃避光春化2 d后，移至22 ℃光照培养箱黑暗催芽3 d。将发芽的拟南芥（5株）移入不同处理的培养基中，山梨醇添加浓度为1.5 g·mL–1，SQR9-gfp发酵液浓度要达到1.0×108 CFU·mL–1。培养皿外用封口膜（Parafilm）封住。22℃，16 h光照/8 h黑暗交替下16 d后观察拟南芥长势。
1.3 测定方法土壤中可培养微生物数量的测定：本实验中涉及的可培养微生物包括Bacillus amyloliquefaciens SQR9-gfp、放线菌、细菌、真菌，全部采用梯度稀释平板计数法测定，操作如下：称取根际土（根际土提前过筛）5 g溶于45 mL无菌水中，放入摇床以175 r·min–1振荡30 min，然后进行系列梯度稀释，吸取0.1 mL不同稀释度土壤悬液涂布于相应的选择性固体培养基上，细菌、芽孢杆菌放置于29 ℃培养箱中培养24 h后计数；放线菌于30 ℃培养箱中培养3 d后计数；真菌于28 ℃培养箱中3~4 d后计数。微生物数量以每克土壤的干物质量计算，以CFU·g–1表示。
黄瓜生物学性状的测定：黄瓜于移栽后25 d时测定各处理的株高、茎粗、叶绿素相对含量测量值（SPAD）、地上部分鲜物质量和干物质量。SPAD、株高和茎粗分别选用叶绿素测定仪（SPAD-502 Plus，KONICA MINOLTA，日本）、钢卷尺和得威斯游标卡尺进行测定；地上部鲜物质量和干物质量用百分之一天平进行测定。
土壤中速效养分的测定：土壤有效磷采用0.5 mol·L–1碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定，利用乙酸铵浸提—火焰光度计法测定土壤速效钾。土壤铵态氮和硝态氮含量的测定：称取过20目筛的土样3 g于50 mL离心管中，然后加入25 mL 0.01 mol·L–1氯化钙浸提溶液，旋紧离心管的瓶塞，放置于摇床上，室温下170 r·min–1，震荡30 min后过滤于10 mL离心管中，最后用流动分析仪（Seal Auto Analyzer AA3，德国）测定铵态氮、硝态氮含量。
作物养分的测定：植物全氮测定采用凯氏法，即用浓硫酸和混合加速剂消煮黄瓜样品，将有机氮转化为铵态氮后用蒸馏滴定法测定。植物全磷测定采用H2SO4-H2O2消煮，钼锑抗比色法测定。植物全钾测定采用火焰光度计法[20]。测定方法参考鲍士旦[21]方法进行。
IAA的检测采用Salkowski比色法。标准曲线采用IAA标准品（Sigma）制作。配制的IAA溶液浓度依次为10、20、30、40、50 mg·L–1，分别取上述IAA溶液0.5 mL，等体积加入S2比色液，在黑暗中静置30 min后使用酶标仪（Molecular Devices，M5，美国）测定OD535值，以加入了比色液的Landy培养基调零，重复三次，获得数据制作标准曲线。
将解淀粉芽抱杆菌的菌悬浮液按8 000 r·min–1、4 ℃离心10 min后取上层发酵液0.5 mL，以1︰1的比例加入S2比色液，避光反应30 min，其中以Landy培养基为空白对照。若反应液变为红色，则说明发酵液中含IAA类似物，且颜色越深表示IAA含量越高。用分光光度计测定OD535值，用相应的标准曲线计算出该菌株产IAA的量。S2比色液：4.5 g三氯化铁溶于300 mL蒸馏水中，缓慢加入597.4 mL 98%浓硫酸，冷却后于容量瓶中定容至1 000 mL，比色液IAA测定范围为5~200 mg·L–l。
1.4 数据处理采用Excel 2016和SPSS13.0软件进行数据统计分析，使用最小显著差异法（least significant difference，LSD）检验进行多重比较（P < 0.05）。
2 结果与讨论 2.1 不同肥料处理对黄瓜生物学性状的影响不同施肥处理对黄瓜生物学性状具有显著影响（图 1）。OF+SQR9-gfp+S处理的株高相比OF+S增加了2.67倍，较OF+SQR9-gfp增加了1.76倍，较OF增加了3.24倍；OF+SQR9-gfp+S的茎粗相比OF+S增加了1.77倍，较OF+SQR9-gfp增加了1.43倍，较OF增加了2.06倍；OF+SQR9-gfp+S的总根长相比OF+S增加了2.15倍，较OF+SQR9-gfp增加了1.88倍，较OF增加了2.29倍；OF+SQR9-gfp+S的总根表面积相比OF+S增加了2.32倍，较OF+SQR9-gfp增加了2.02倍，较OF增加了2.33倍；OF+SQR9-gfp+S、OF+SQR9-gfp和OF+S与OF相比，地上部分鲜物质量和干物质量均有所增加，OF+SQR9-gfp+S显著高于OF+SQR9-gfp和OF+S（P < 0.05），OF+S与OF相比差异不显著。说明OF+SQR9-gfp+S能够提高黄瓜地上部分鲜物质量和干物质量。综上所述，OF+SQR9-gfp+S对黄瓜有明显的促生效果，这与前期大量的研究结果一致，说明SQR9-gfp是一株优秀的植物促生菌，施用该菌株研制的生物有机肥能够显著促进作物生长[22-24]。
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注：OF+S：普通有机肥+山梨醇；OF+SQR9-gfp+S：普通有机肥+解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp +山梨醇；OF：普通有机肥；OF+SQR9 gfp：普通有机肥+解淀粉芽孢杆菌SQR9 gfp。下同。 Note: OF+S: organic fertilizer+sorbitol; OF+SQR9-gfp+S: organic fertilizer+Bacillus amyloliquefaciens SQR9-gfp+sorbitol; OF: organic fertilizer; OF+SQR9-gfp: organic fertilizer+Bacillus amyloliquefaciens SQR9-gfp. The same below. 图 1 不同施肥处理对黄瓜生物学性状的影响 Fig. 1 Effect of different fertilizer treatments on biological characteristics of cucumber |
不同施肥处理对土壤中速效钾的影响如图 2左所示：OF+SQR9-gfp+S处理的速效钾含量最高，为249.8 mg·kg–1。OF+SQR9-gfp+S处理与OF+S处理、OF处理、OF+SQR9-gfp处理之间有显著性差异。不同施肥处理对土壤中有效磷的影响如图 2右所示：OF+SQR9-gfp+S处理的有效磷含量最高，为128.2 mg·kg–1。OF+SQR9-gfp+S处理与OF+S处理、OF处理、OF+SQR9-gfp处理之间有显著性差异。表明添加山梨醇和SQR9-gfp能明显改善土壤的理化性质，提高土壤中速效钾和有效磷的含量，同时添加山梨醇和SQR9-gfp的处理效果最优，其次是单独添加山梨醇或者SQR9-gfp的处理。
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图 2 不同施肥处理对土壤速效钾和有效磷的影响 Fig. 2 Effect of different fertilizer treatments on available K and P in the soil |
不同施肥处理对土壤中铵态氮和硝态氮含量具有显著影响（图 3）。OF+SQR9-gfp处理的铵态氮含量最高，达到31.43 mg·kg–1，其次是OF、OF+S、OF+SQR9-gfp+S处理。各处理之间均存在显著差异。OF+S处理的硝态氮含量最高，达到246.5 mg·kg–1，其次是OF+SQR9-gfp+S、OF、OF+SQR9-gfp处理。OF+S与OF、OF+SQR9-gfp处理之间均有显著差异；OF+SQR9-gfp+S与OF、OF+SQR9-gfp处理之间也均有明显差异。施用含山梨醇的生物有机肥能有效提高土壤速效养分的含量，进而促进植物的生长。王华等[25]研究表明，施用生物有机肥能显著提高油茶园土壤中的铵态氮和硝态氮含量。张迎春等[26]研究表明，在莴笋种植过程中，生物有机肥部分代替化肥，土壤中各养分含量均有明显提高，硝化细菌数量也有明显的增加。上述研究均说明施用生物有机肥能有效提高土壤中有效养分的含量。土壤氮素的矿化和硝化作用受微生物的影响，微生物参与并调控其过程[27]。含山梨醇的生物有机肥的施用给土壤微生物提供了碳源，有利于提高土壤微生物多样性，其中易利用的碳源能迅速改善微生物的营养条件，促进微生物快速大量繁殖及新陈代谢，提升了土壤生物肥力水平，有利于土壤营养元素的矿化与活化[28-29]。碳源的添加能够显著提高固氮菌的固氮酶活性[30]，山梨醇的添加也能显著提高土壤固氮酶活性，进而提高了土壤氮素营养水平。菌剂的添加本身引入了一部分营养元素，也有利于提高土壤化学肥力水平。
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图 3 不同施肥处理对土壤中铵态氮（左）和硝态氮（右）含量的影响 Fig. 3 Effect of different fertilizer treatments on the contents of ammonium(left)and nitrate(right)nitrogen in the soil |
不同施肥处理黄瓜植株的养分含量如表 1所示，在不同施肥处理中，OF+SQR9-gfp+S处理的黄瓜全氮、全磷、全钾的含量最高，分别达到了19.85 mg·kg–1、5.01 mg·kg–1、23.87 mg·kg–1。OF+ SQR9-gfp+S处理植株全氮含量较OF处理高43.6%；OF+SQR9-gfp+S处理吸收的全磷较OF处理高2.29倍；OF+SQR9-gfp+S处理的钾肥利用率较OF处理高23.7%。综上所述，相比单独添加山梨醇、单独添加解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp和OF的处理，在同时添加山梨醇和解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp的生物有机肥处理中，作物能更大限度地汲取土壤和肥料中的养分。
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表 1 不同施肥处理下黄瓜植株养分含量 Table 1 Effects of different fertilizer treatments on nutrient absorption of cucumber/(mg·kg–1) |
不同施肥处理对土壤中微生物数量的影响如图 4所示。就不同处理的真菌数量而言，OF+SQR9- gfp+S与OF+SQR9-gfp处理之间有明显差异；OF+SQR9-gfp+S与OF、OF+SQR9-gfp+S与OF+S无明显差异，但OF+SQR9-gfp+S真菌数量均高于OF和OF+S处理。就不同处理的细菌数量而言，OF+ SQR9-gfp+S与OF相比，具有显著差异；OF+SQR9- gfp+S与OF+S无显著差异，但OF+SQR9-gfp+S的细菌数量高于OF+S。就不同处理的放线菌数量而言，OF+SQR9-gfp优于其他处理，具有显著差异；OF与OF+S处理相比具有显著差异，且施加SQR9-gfp的处理最优。就不同处理的SQR9-gfp数量而言，OF+SQR9-gfp+S与OF+SQR9-gfp处理相比无明显差异，但OF+SQR9-gfp+S处理中SQR9-gfp的数量高于OF+SQR9-gfp处理，这可能是因为山梨醇促进SQR9-gfp定殖的作用主要体现在施用初期，在初期OF+SQR9-gfp+S处理中SQR9-gfp的数量较高，随着黄瓜盆栽周期延长，山梨醇很快被消耗完，而菌株SQR9-gfp的数量也随之下降，因此，添加山梨醇对解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp的定殖具有积极的作用。有研究[31-32]表明，生物有机肥施用后能促进根际土壤中细菌、放线菌的增殖，从而抑制病原真菌的繁殖，降低真菌数量，进而改善微生物群落结构。而本研究发现，OF+SQR9-gfp+S处理的细菌、真菌数量要高于OF+SQR9-gfp处理，其放线菌数量低于OF+SQR9-gfp处理。因此，施用含山梨醇和SQR9-gfp的生物有机肥对改善土壤的微生物群落结构，激活土壤生物活性，提高土壤生物肥力具有积极的意义。
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图 4 不同施肥处理对土壤中可培养真菌、细菌、放线菌和SQR9-gfp数量的影响 Fig. 4 Effect of different fertilizer treatments on the amount of microorganism in the soil |
山梨醇对SQR9-gfp分泌IAA的影响如图 5所示。以解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp为供试菌株，采用Salkowski比色液显色法定量测定菌株在山梨醇不同浓度梯度下产IAA能力。结果显示：随着山梨醇浓度的增加，SQR9-gfp分泌IAA的能力不断增加，山梨醇15 mg·L–1时达到最大值，且与其他处理有显著差异。生长素的作用是促进细胞分裂和器官的生长，引起植物向地性反应，促进植物雌花分化等[33]。自然界中不仅植物可以合成IAA，许多微生物同样具有分泌IAA的能力，可促进植物生长[34]。
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图 5 不同山梨醇浓度对SQR9-gfp产IAA的影响 Fig. 5 Effects of different sorbitol concentrations on IAA production by SQR9-gfp |
不同处理下拟南芥根系会发生构型变化如图 6所示。在Col-0野生型中，山梨醇+SQR9-gfp处理的根长显著高于其他处理；在IAA不敏感突变体pin2中，山梨醇+SQR9-gfp处理的根长未显著高于其他处理，且各处理间无显著差异。当山梨醇浓度达到10 mg·L–1时，会显著提高SQR9的定殖水平[16]。本研究发现，添加山梨醇能够促进菌株SQR9-gfp合成生长素，并且在纯培养条件下当山梨醇添加量为15 mg·L–1时达到最大值。此外，pin蛋白与生长素的极性运输有关，pin突变体常表现出生长素运输异常[35]。本研究通过野生型和IAA不敏感突变型pin2拟南芥对比试验，证实了添加山梨醇促进菌株SQR9-gfp分泌IAA是该新型生物有机肥促进植物生长的机理之一。IAA、细菌和植物三者为相互作用、协调的有机整体，构成一幅动态的复杂调控网络。
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注：S：山梨醇；SQR9-gfp：解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp；SQR9-gfp+S：解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp +山梨醇；Col-0：哥伦比亚野生型拟南芥；pin2：IAA不敏感型拟南芥突变体。 Note: S: sorbitol; SQR9-gfp: Bacillus amyloliquefaciens SQR9-gfp; SQR9-gfp+S: Bacillus amyloliquefaciens SQR9-gfp+sorbitol; Col-0:colombian wild type Arabidopsis; pin2: IAA-insensitive Arabidopsis mutant. 图 6 不同处理下拟南芥根系发生的构型变化 Fig. 6 The response of Arabidopsis root architecture to different treatments |
本研究以广泛应用的具有促生以及生防效果的菌株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SQR9-gfp为目标菌株，加入该菌株偏好的碳源山梨醇研制出一种新型的生物有机肥，施用该生物有机肥显著促进植物的生长，添加山梨醇能进一步提升生物有机肥的促生作用，提升土壤有效养分含量。添加山梨醇能有效提高菌株SQR9-gfp分泌IAA，进而促进植物根系生长，这也是添加山梨醇能够进一步提升含解淀粉芽孢杆菌SQR9-gfp的生物有机肥促生效应的机理之一。本研究提出了新型生物有机肥研发的新思路，为植物促生菌新应用模式的开发提供了理论依据。
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