2022, Vol. 59
表1(Table 1)
2. 湖南农业大学资源环境学院，长沙 410128
2. College of Environment and Resources, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
微生物介导的稻田土壤氮循环对稻田生产力和生态环境产生影响。传统观点认为稻田土壤氮损失途径为氨挥发、反硝化和淋溶损失作用，但我国农业土壤仍有13%的氮素去向未知[1]。近年来的研究表明厌氧氨氧化是稻田生态系统氮损失的重要原因[2-3]。对南方典型水稻土的研究发现每年约2.5×106 Mg氮通过厌氧氨氧化损失到大气中，占氮肥施用量的10%[4]。Nie等[3]认为农业土壤的厌氧氨氧化对氮气损失的贡献量为5%~10%，表明农田土壤厌氧氨氧化与氮素损失关系密切。
环境因素是决定厌氧氨氧化菌活性与分布的主要原因。相比于海洋和淡水生态系统，土壤环境中的厌氧氨氧化菌的活性、丰度与生物多样性更高，原因是土壤环境异质性较大，而厌氧氨氧化菌本身具有代谢多样化的特点，土壤可为其提供有利生境[3]。农业土壤中可检测到各种不同的厌氧氨氧化菌，最常见的两类是Brocadia和Kuenenia。农业土壤系统由于大量氮肥的投入，刺激了厌氧氨氧化菌的生长，提高了其丰度和活性，加快了土壤氮素损失[3]。目前对厌氧氨氧化的研究集中于低氧或厌氧环境。溶解氧是厌氧氨氧化过程的重要调控因子，厌氧氨氧化菌对环境中的氧具有一定的耐受力，但高氧浓度条件下具有明显抑制作用[5]。有研究表明，在氧分压 < 0.4%的环境中，厌氧氨氧化过程可正常进行；但在高氧浓度时发生不可逆的抑制作用[6]。淹水稻田表层土壤氧分压较高但亚表层以下土壤氧气浓度较低[7]，受不同农田管理方式的影响，如秸秆还田后微生物对有机物料的降解、不同耕作方式对土壤的扰动强度的差别，可能在不同时期造成土壤中氧分压发生差异，因此稻田厌氧氨氧化菌活性、菌群丰度和多样性对农田管理方式的响应值得探索。
秸秆还田和耕作方式影响厌氧氨氧化过程。顾超[8]的研究表明，水旱轮作系统中，秸秆还田后土壤的厌氧氨氧化反应速率明显变低，秸秆中有机碳抑制了土壤厌氧氨氧化活性；但周慧芳[9]发现稻草还田后提高了厌氧氨氧化活性和厌氧氨氧化菌数量，需深入研究秸秆还田对厌氧氨氧化过程的影响。土壤耕作使土壤中水、肥、气、热等发生改变，进而影响土壤微生物的活性与群落结构[10]。南方稻田土壤常见的耕作方式有翻耕、旋耕及少免耕等。免耕改善了土壤理化性质，可提高水稻产量[11]，而翻耕和旋耕在一定程度上破坏了土壤结构和土壤微生物生存环境[12]。本研究选择中国南方典型稻区土壤，研究经过15 a不同耕作措施和秸秆还田对厌氧氨氧化过程的影响，重点分析厌氧氨氧化菌的潜在活性、功能基因丰度和群落组成差异。采用15N示踪培养分析厌氧氨氧化速率，定量厌氧氨氧化功能基因，通过Illumina测序平台检测厌氧氨氧化菌群落组成，旨在探讨不同耕作方式与秸秆还田对水稻土厌氧氨氧化过程的影响，为预测稻田生态系统氮损失、合理有效氮调控提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计研究依托2005年建立于湖南省宁乡市回龙铺镇（28°07'N，112°18'E）的长期定位试验，种植制度为冬闲-早稻-晚稻，土壤类型为红壤水稻土。试验开始前耕作层（0~20 cm）土壤有机质34.90 g·kg–1，全氮1.29 g·kg–1，pH6.26，容重1.21 g·cm–3。设置4个处理：（1）秸秆不还田+翻耕（CT：conventional till）、（2）秸秆还田+翻耕（CTS：conventional till + rice straw）、（3）秸秆还田+旋耕（RTS：rotary till + rice straw）、（4）秸秆还田+免耕（NTS：no till + rice straw），每个处理3次重复。小区之间用水泥埂隔开，采用随机区组排列。CT处理在种植水稻前翻地1次，旋耕2次，水稻收获后秸秆全部移出；CTS处理耕作方式与CT处理一致，但秸秆全量还田；RTS处理在水稻抛秧前旋耕4次，秸秆全量还田；NTS处理免耕，秸秆全部覆盖还田。秸秆还田量多年平均值为12 500 kg·hm–2。抛秧前基施复合肥391 kg·hm–2（N 195.5 kg·hm–2，P 34.14 kg·hm–2，K 97.33 kg·hm–2），返青后追施尿素47 kg·hm–2（N 21.62 kg·hm–2）。晚稻抛秧前基肥施用复合肥469 kg·hm–2（N 234.50 kg·hm–2，P 40.95 kg·hm–2，K 116.75 kg·hm–2），返青后追施尿素39 kg·hm–2（17.94 kg·hm–2）。各处理其他田间管理措施保持一致。
1.2 土壤样品采集与理化性质分析定位试验开始第15年，在前茬稻草全部还田且耕作未开始之前采集土壤样品，采样深度0~15 cm，采样时间为2019年3月。采用对角线采样法，每个小区用不锈钢土钻采集5个土壤样品，迅速混匀，取少部分置于自封袋后密闭保存于冰盒内用于绝对定量PCR和高通量测序分析，其他样品带回实验室分析。土壤pH和电导率（盐度）分析采用多参数测定仪（SX751，中国）测定，液土比为2.5：1。土壤有机质分析采用重铬酸钾容量法。全氮采用凯氏消煮法，铵态氮和硝态氮采用KCl（2 mol·L–1）浸提，凯氏定氮仪（K9860，中国）测定。土壤容重分析采用环刀法。具体方法参考《土壤农业化学分析方法》[13]。
1.3 15N稳定同位素分析采用稳定同位素技术分析厌氧氨氧化潜势，可同时分析反硝化潜势，分析方法参照聂三安等[14]的方法。根据厌氧氨氧化和反硝化产生氮气的原理不同，通过氮同位素标记以区分二者产生的氮气量，估算厌氧氨氧化和反硝化潜势。称取3.50 g鲜土至20 mL柱状培养管中，加满氮气饱和的去离子水，厌氧预培养至少24 h以消耗硝酸盐。预培养结束后，培养管加入配制好的同位素溶液至无机氮总浓度为100 μmol·L–1。每个样品分为3个处理添加不同同位素：处理1加入99.09%的15NH4Cl，在0 h和24 h加入200 µL ZnCl2（7 mol·L–1）以终止反应，验证硝酸盐消耗彻底；处理2加入99.09%的15NH4NO3，在0 h和24 h加入ZnCl2，验证是否发生厌氧氨氧化反应；处理3加入99.21%的Na15NO3，分别在加入同位素溶液后的0、3、6、12和24 h加入ZnCl2，通过氮气产生量对时间的线性回归方程计算厌氧氨氧化反应潜势。反应终止后，在厌氧培养箱内将2 mL反应液转移至新的柱状培养管中，剧烈摇晃释放氮气，产生的氮气同位素（28N2、29N2、30N2）由稳定同位素质谱仪连接Gasbench进行分析。
1.4 DNA提取与qPCR采用FastDNAⓇ Spin Kit for Soil试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）的方法提取土壤总DNA，之后采用超微量紫外分光光度计（Nanodrop 2000）检测DNA纯度和浓度。采用绝对定量的方法分别检测DNA样品中的厌氧氨氧化功能基因hzsB和细菌总数的拷贝数。细菌16S引物为341F-517R，厌氧氨氧化菌定量引物采用396F-742R。反应体系和扩增条件如表 1，定量PCR检测仪器为ABI7500。
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表 1 细菌16S rRNA和厌氧氨氧化hzsB基因反应体系和扩增条件 Table 1 Reaction mixture and profiles used for real-time qPCR |
采用巢式PCR对厌氧氨氧化菌的16S rRNA基因进行扩增。第一次采用引物PLA46f-630对浮霉菌属进行扩增，第二步以第一步PCR产物稀释300倍后作为模板，用厌氧氨氧化菌特异性引物Amx368F-Amx820R进行全长PCR扩增。反应体系和反应条件参照Hefting等[15]的方法。PCR产物经电泳检测和纯化后，通过Illumina MiSeq平台（美吉生物医药科技有限公司，上海）进行测序。
1.6 数据处理与分析所有数据均为3个生物学重复，数据处理采用Microsoft Excel 2016，图形处理采用Sigmaplot 14.0，正态分布检验与相关性分析采用IBM SPSS Statistics 25，方差齐性采用Duncan检验，方差不齐采用Dunnett’s T3检验，在P < 0.05水平表示显著性差异。相关性分析采用双尾检验，分别在0.05和0.01水平表示显著和极显著相关。高通量测序分析在美吉生物云平台运行。
2 结果 2.1 不同耕作方式与秸秆还田对土壤理化性质的影响经过15年的秸秆还田与耕作管理，土壤的主要理化性质发生了不同程度变化，总体上改善了水稻土肥力状况（表 2）。各处理间土壤pH无显著差异，说明秸秆还田和不同耕作方式均对水稻土pH无显著性影响。CTS、RTS和NTS处理土壤有机质、全氮、盐度显著性高于CT处理（CTS全氮含量大于CT，但未达到显著性水平）。各处理土壤硝态氮含量均较低，从数量级上相比低于铵态氮含量。CTS和CT处理相比NH4+浓度无显著差异，但均显著性低于RTS和NTS处理，说明翻耕条件下，秸秆还田并未显著提高铵态氮浓度；但秸秆还田条件下，旋耕和免耕可显著提高土壤铵态氮浓度。NTS处理的土壤容重显著高于其他处理，且CT、CTS和RTS处理间差异不显著，因此免耕提高了水稻土的容重。
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表 2 不同耕作方式与秸秆还田下土壤理化性质 Table 2 Effects of different tillage practices and rice straw return on soil physical-chemical properties(n=3) |
同位素示踪培养实验中土壤厌氧氨氧化和反硝化潜在活性见图 1。厌氧培养条件下，各处理土壤反硝化活性为N 7.45~12.33 nmol·g–1·h–1，而厌氧氨氧化活性为0.49~1.17 nmol·g–1·h–1，反硝化活性远大于厌氧氨氧化活性。处理间反硝化活性与厌氧氨氧化活性之间存在显著性相关关系（表 3）。CTS的反硝化活性（7.45 nmol·g–1·h–1）和厌氧氨氧化活性（0.49 nmol·g–1·h–1）显著低于CT处理（分别为9.21 nmol·g–1·h–1和0.61 nmol·g–1·h–1），说明翻耕条件下，秸秆还田降低了水稻土反硝化和厌氧氨氧化活性。秸秆还田条件下，不同耕作方式之间厌氧氨氧化和反硝化活性表现为NTS > RTS > CTS（P < 0.05），因此，不同耕作方式显著改变了厌氧氨氧化和反硝化微生物活性，免耕提高了稻田土壤潜在氮素损失，而翻耕可能会减少氮损失。
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图 1 秸秆还田与不同耕作方式下水稻土反硝化和厌氧氨氧化活性 Fig. 1 Potential denitrification and anammox activity of soil under straw returning and different tillage practices |
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表 3 不同处理厌氧氨氧化活性、基因丰度、群落相对丰度与土壤理化性质的皮尔森相关性（n=4） Table 3 Pearson correlations between anammox indexes and physicochemical properties in different treated paddy soils(n=4) |
通过对16S rRNA基因和hzsB功能基因定量分析土壤中总细菌与厌氧氨氧化细菌的丰度（图 2a）。各处理总细菌数量具有一定差异，NTS处理（1.66×109 copies·g–1）显著性高于其他处理，而CTS与RTS之间无显著性差异（分别为8.25×108 copies·g–1和1.07×109 copies·g–1），CT处理最低（4.93×108 copies·g–1）。因此，尽管耕作方式不同，但秸秆还田后土壤细菌总量均显著性高于对照处理。此外，免耕处理也有利于细菌的富集。四个处理厌氧氨氧化功能基因hzsB拷贝数为1.2×106~1.61×106 copies·g–1，且处理之间无显著性差异。不同处理之间厌氧氨氧化菌占细菌的比例表现为CT > CTS > RTS > NTS，说明秸秆还田降低了厌氧氨氧化菌的相对比例，但翻耕和旋耕提高了其在水稻土中的相对比例。以上结果表明，水稻土秸秆还田或免耕均利于土壤细菌的富集，但厌氧氨氧化菌的生长可能受土壤综合因子的调控。
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图 2 秸秆还田与不同耕作方式下土壤厌氧氨氧化菌和细菌总量丰度（a）、土壤厌氧氨氧化菌群落组成与相对丰度（b） Fig. 2 Abundance of hzsB gene of anammox and total bacteria(a) and composition and relative abundance of soil anammox bacteria(b) in soil under straw returning and different tillage practices |
总体而言，不同处理之间厌氧氨氧化菌的组成较为相似，但相对丰度有所差异。各处理中均检测到Kuenenia和Scalindua（属水平），且Kuenenia属的相对丰度含量范围74.05%~93.03%，高于Scalindua（6.11%~23.37%），此外还有少量未鉴定浮霉菌属（0.39%~1.87%）（图 2b）。与CT比，CTS和NTS处理Kuenenia属的相对丰度无显著性差异，但RTS处理显著更高，说明旋耕加秸秆还田更有利于Kuenenia属厌氧氨氧化菌的积累。Scalindua的相对丰度，CTS显著低于CT处理，说明翻耕条件下，秸秆还田降低了其相对丰度；不同翻耕处理之间表现为NTS > CTS > RTS，说明旋耕不利于Scalindua的生长。因此，秸秆还田和耕作方式未改变水稻田厌氧氨氧化菌的群落组成，但改变了主要菌属的相对丰度。
2.5 相关性分析表 3列出了本研究中厌氧氨氧化的重要参数（潜在活性、功能基因丰度、群落相对丰度）与土壤关键因子之间的皮尔森相关性。土壤细菌总数、容重、有机质与全氮含量之间均显著相关，说明秸秆还田和不同耕作后，水稻土的碳、氮供应潜力与土壤细菌总数和容重密切相关。此外，厌氧氨氧化活性与土壤反硝化活性显著相关（P < 0.01），而与功能基因hzsB丰度、NH4+和NO3–浓度无显著相关性。不同处理间厌氧氨氧化功能基因hzsB丰度无显著性差异（图 2a），且与群落组成相对丰度和土壤理化因子均无显著相关性。Kuenenia相对丰度与Scalindua极显著负相关（P < 0.01），说明秸秆还田和耕作方式可能对水稻土关键厌氧氨氧化菌的影响不同。推测秸秆还田和不同耕作处理后，水稻土厌氧氨氧化过程受土壤综合因素的影响。
3 讨论 3.1 厌氧氨氧化活性响应不同耕作方式与秸秆还田本研究采用稳定同位素示踪分析厌氧氨氧化活性，由于未考虑某些其他过程（如共反硝化、铁氨氧化等），结果可能高估了厌氧氨氧化的活性。厌氧培养条件下，反硝化和厌氧氨氧化的最终产物为氮气，厌氧氨氧化对氮气损失的贡献为6.17%~8.67%，剩余由反硝化产生（图 1），且二者活性显著正相关（表 3）。该结果反映了厌氧氨氧化对稻田土壤氮损失的贡献比例，与Nie等[3]的结果一致。稻田土壤反硝化作用强烈，为厌氧氨氧化提供亚硝酸盐作为反应底物，对长期不同施肥水稻土的研究也发现，反硝化是决定厌氧氨氧化的关键因子[16]，二者具有潜在耦合性[3]。
土壤理化因子与厌氧氨氧化活性无显著相关性（表 3），很可能与秸秆还田后多种因素的综合影响有关。秸秆作为有机物料，还田后改善土壤物理、化学和生物学性质[17]。本研究中，翻耕加秸秆还田处理的厌氧氨氧化和反硝化活性显著低于对照，说明水稻秸秆还田可在一定程度上减少氮损失。通常水稻秸秆C/N比较高，分解较慢，一定程度上抑制氮矿化[18]，减缓氮损失。王改玲等[19]认为，土壤中加入高C/N比的秸秆后会发生生物固定，在高氮水平时，可降低反硝化速度；秸秆分解过程中还可能发生化感作用，抑制反硝化，而反硝化与厌氧氨氧化具有正相关性（表 3）。此外，秸秆还田后有机物的增加可能抑制了厌氧氨氧化菌的脱氮功能[20]，降低了其反应活性。这些因素在不同程度上影响了稻田土壤的厌氧氨氧化过程。秸秆还田后，土壤的厌氧氨氧化受土壤整体环境条件而非微观环境的综合调控，其关键的环境驱动因子有待深入研究。
不同耕作方式下土壤厌氧氨氧化活性由低至高依次为翻耕、旋耕、免耕（P < 0.05），很可能与土壤理化性质差异有关。厌氧氨氧化菌生长较为缓慢，偏好较为稳定的环境[21]，而免耕对水稻土扰动较少，这种长期且稳定的厌氧环境有利于厌氧氨氧化菌的生长和代谢。此外，免耕条件下土壤总有机质、全氮、盐度均较高（表 1），可为厌氧氨氧化菌的代谢提供更为充足的底物。而翻耕或旋耕对土壤的扰动加快了土壤中的物质与能量交换，土壤养分总体上低于免耕处理[22]，因此，其厌氧氨氧化菌的代谢受到一定程度影响，显著低于免耕处理。稻田土壤中，耕作方式显著影响了反硝化和厌氧氨氧化，其活性受土壤环境的稳定性的影响。
3.2 厌氧氨氧化菌丰度与不同耕作方式与秸秆还田水稻土长期淹水和氮肥投入形成的厌氧且高氮条件可为厌氧氨氧化菌的生长提供有利生境[3]。本研究中，水稻土厌氧氨氧化菌丰度为1.20×106~1.61×106 g–1，其值范围与长期施用粪肥的水稻土（2.0×105~2.7×106 g–1）[23]及长期不同施肥的水稻土（1.3×106~3.6×106 g–1）[24]较为相近。秸秆还田后，改善了土壤理化性质（表 1），土壤养分呈增加趋势[25]，本研究中总细菌数量处理显著高于对照也印证了这一观点（图 2a）。然而，各处理间厌氧氨氧化菌丰度无显著性差异（图 2a），推测受可利用底物的影响。一方面，各处理土壤中铵盐浓度较高但硝酸盐浓度均较低，厌氧氨氧化菌对亚硝酸盐的利用受限；另一方面，秸秆还田处理有机质含量显著高于对照（表 1），可能抑制了厌氧氨氧化菌的生长，因为较高的有机质为反硝化微生物提供了充足的氮源，其对底物的利用强于厌氧氨氧化菌，这一点在生物反应器中的研究已经得到印证[26]。因此，尽管秸秆还田和不同耕作方式改善了土壤理化性质，提高了水稻土肥力水平，但厌氧氨氧化菌的生长可能受稻田土壤综合因素的影响。同时，相关性分析表明，厌氧氨氧化菌丰度与其活性及土壤理化因子无显著相关性（表 3），很可能因本研究仅在DNA水平进行厌氧氨氧化微生物的丰度分析，无法准确定量活性厌氧氨氧化菌的数量。本研究仅对上层水稻土进行分析，受氧气渗透的影响，土壤表层的部分厌氧氨氧化菌可能处于休眠状态[3]。
3.3 厌氧氨氧化菌群落响应不同耕作方式与秸秆还田稻田生态系统最常见的厌氧氨氧化菌为Brocadia和Kuenenia，本研究中鉴定出Kuenenia和Scalindua，很可能与母质有关。在不同水稻土中均检测到不同丰度的Kuenenia[7]，说明其可适应稻田生态系统。Scalindua通常与盐度密切相关，如在高盐度的海洋中仅能检测到Scalindua[27]，在河口和河流沉积物中Scalindua与盐度密切相关[28]。通常水稻土盐度与海洋或沉积物存在较大差异，因此仅在某些水稻土中能检测到一定丰度的Scalindua。对黄泥田水稻土的研究发现长期有机-无机配施肥后显著提高了土壤盐度，有利于Scalindua的生长[24]。对东北地区的白浆水稻土的研究发现Scalindua是厌氧氨氧化优势菌属，很可能与其高盐基饱和度有关[29]。本研究中水稻土母质为河沙泥，其盐度含量较高（表 1），因此可检测到一定数量的Scalindua。对照与免耕加秸秆还田处理Kuenenia和Scalindua相对丰度均无显著性差异，但翻耕加秸秆还田及旋耕加秸秆还田后其相对丰度发生了显著变化（图 2b），说明秸秆还田和耕作同时影响了厌氧氨氧化菌的群落组成。秸秆还田后对水稻土进行不同程度的耕作，有利于Kuenenia的生长。相关分析表明，不同耕作方式与秸秆还田处理之间Kuenenia和Scalindua相对丰度具有显著负相关性，但与活性无显著关系，很可能与其代谢差异性有关。推测Kuenenia可能对土壤耕作不敏感，而稳定的土壤条件可能更有利于Scalindua的生长。
4 结论稻田长期不同耕作方式与秸秆还田措施下，厌氧氨氧化活性发生不同变化，但厌氧氨氧化菌功能基因丰度无显著性差异，厌氧氨氧化菌群落种类未发生改变但相对丰度发生了变化，厌氧氨氧化过程很可能受土壤秸秆还田后综合因素的调控。以后研究可重点关注厌氧氨氧化过程对秸秆还田后的响应机理。
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