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  土壤学报  2023, Vol. 60 Issue (2): 535-545  DOI: 10.11766/trxb202106070299
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引用本文  

郭茹, 温腾, 曹亚澄, 等. 反硝化细菌法测定土壤NO−2−15N丰度的方法优化. 土壤学报, 2023, 60(2): 535-545.
GUO Ru, WEN Teng, CAO Yacheng, et al. Optimization of Denitrifier Method for Determination of Soil NO−2−15N Abundance. Acta Pedologica Sinica, 2023, 60(2): 535-545.

基金项目

国家自然科学基金项目（41977084）资助

通讯作者Corresponding author

温腾, E-mail：wenteng@njnu.edu.cn

作者简介

郭茹（1997—），女，山西运城人，硕士研究生，主要从事土壤氮转化研究。E-mail：guoru08024@163.com
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
反硝化细菌法测定土壤NO−2−15N丰度的方法优化
郭茹1, 温腾1,2,3,4, 曹亚澄5, 张金波1,2,3,4    
1. 南京师范大学地理科学学院, 南京 210023;
2. 江苏省地理环境演化国家重点实验室培育建设点, 南京 210023;
3. 江苏省地理信息资源开发与利用协同创新中心, 南京 210023;
4. 虚拟地理环境教育部重点实验室(南京师范大学), 南京 210023;
5. 土壤与农业可持续发展国家重点实验室(中国科学院南京土壤研究所), 南京 210008
收稿日期：2021-06-07；收到修改日期：2021-08-13；优先数字出版日期(www.cnki.net)：2022-09-09
基金项目：国家自然科学基金项目（41977084）资助
作者简介：郭茹（1997—），女，山西运城人，硕士研究生，主要从事土壤氮转化研究。E-mail：guoru08024@163.com.
通讯作者Corresponding author：温腾, E-mail：wenteng@njnu.edu.cn.
摘要：NO−2是土壤中多个氮转化过程的关键中间产物，具有浓度低、转化快的特点。反硝化细菌法与质谱技术相结合，已广泛用于NO−3或NO−2的15N同位素分析。本文旨在优化现有Stenotrophomonas nitritireducens反硝化细菌法的培养和反应条件，实现对土壤浸提液中NO−2 - 15N丰度的专一、快速、准确测定。结果表明，使用种子液好氧摇培与单菌落微氧培养对NO−2样品的15N同位素测定无显著差异，种子液可保证不同批次菌体的稳定性，好氧培养可将培养时间从7~8 d缩短至12~15 h。高纯N2或He气吹扫0.5 h均能有效去除O2和空白杂质氮，但N2吹扫成本更低。转移N2O气体至干燥气瓶，不影响测定结果的准确性和精密度，还能延长样品保存时间，减少碱蒸汽腐蚀仪器管路。使用处于对数生长期的菌体，调节反应体系的菌体浓度OD600值为0.3~0.9，可保证其反硝化效率，减少不同批次菌体的差异。使用不超过1 mol·L–1的KCl浸提土壤，既可保证提取效率，也能减少对菌体活力的影响。优化后的方法不仅能准确测定不同类型土壤中NO−2的15N丰度，对5~20 nmol自然丰度NO−2的δ15N值测量精度为0.1‰~0.9‰，且大部分 < 0.5‰，还大幅简化了步骤、缩短了实验周期、节约了成本。
关键词：反硝化细菌法    亚硝酸盐    15N    土壤浸提液    
Optimization of Denitrifier Method for Determination of Soil NO−2−15N Abundance
GUO Ru1, WEN Teng1,2,3,4, CAO Yacheng5, ZHANG Jinbo1,2,3,4    
1. School of Geography Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China;
2. State Key Laboratory Cultivation Base of Geographical Environment Evolution (Jiangsu Province), Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China;
3. Jiangsu Center for Collaborative Innovation in Geographical Information Resource Development and Application, Nanjing 210023, China;
4. Key Laboratory of Virtual Geographic Environment (Nanjing Normal University), Ministry of Education, Nanjing 210023, China;
5. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China(No. 41977084)
Abstract: 【Objective】NO−2 is a key intermediate product of several nitrogen transformation processes in soil, with low concentration and fast transformation. The combination of denitrifier method and mass spectrometry technology has been widely used in the 15N isotope analysis of NO−3 or NO−2 in water.【Method】This paper aims to optimize the culture and reaction conditions of Stenotrophomonas nitritireducens denitrifier method, and to realize the specific, rapid and accurate determination of NO−2 - 15N abundance in soil extract. Thus, we will optimize the culture method and reaction conditions, and bacterial concentration of denitrifier method, then applied this method to the soil extract.【Result】There was no significant difference in the 15N isotopic determination of NO−2 samples between aerobic shaking with seed solution and microaerobic incubation of single colonies. The seed solution ensures the stability of different batches of bacteria and aerobic incubation reduces the incubation time from 7~8 days to 12~15 h. High purity N2 or He purging for 0.5 h can effectively remove O2 and blank nitrogen, but the cost of N2 purging is lower. The transfer of N2O gas to the dry gas cylinder did not affect the accuracy and precision of the determination results. However, it can prolong the sample preservation time and reduce alkali steam corrosion of the instrument pipeline. Also, using bacteria in logarithmic growth phase and adjusting the reaction system to an OD600 value of 0.3~0.9 will ensure their denitrification efficiency and reduce variation between batches. Using no more than 1 mol·L–1 KCl to extract the soil will ensure the extraction efficiency and reduce the impact on the viability of the bacteria.【Conclusion】The optimized method can accurately determine the 15N abundance of NO−2 in different types of soil with a measurement accuracy of δ15N of 5~20 nmol and natural abundance value of NO−2 between 0.1‰~0.9‰, with most values being less than 0.5. Also, the experimental period was greatly shortened, simplified steps and save cost.
Key words: Denitrifier method    Nitrite    15N    Soil extract    

土壤氮转化过程是生物地球化学循环的重要环节。土壤中的氮可分为有机态氮和无机态氮，不同形态的氮在生物和化学作用下可相互转化。在无机态氮中NO−2是自养硝化、异养硝化、反硝化等多个氮转化过程的关键中间产物[1-3]，在土壤氮转化过程中不可忽视。NO−2作为一种独立存在的氮库，与气态氮的排放密切相关，其动态和大小直接影响N2O和NO的排放[4-5]。当NO−2的消耗速率小于产生速率时，会在土壤中累积，过量累积后进入水生生态系统会影响人类和其他生物健康，也会造成严重的环境问题。因此，将NO−2纳入生物地球化学模型，有助于进一步了解土壤氮转化过程中氮的损失和保留机制。

NO−2在土壤中代谢迅速，浓度小于1 mg·kg–1（以N计），常低至10 μmol·L–1。土壤中的NO−2可来源于NH+4库、NO−3库和有机氮库，通过自养硝化、异养硝化、反硝化和DNRA等过程转化为NO−2；NO−2的消耗途径也涉及多个氮转化途径，包括硝化作用、反硝化作用、DNRA、厌氧氨氧化和化学反硝化过程[6-7]。有研究发现，KCl溶液提取酸性土壤无机态氮过程中，如未调节提取液pH，NO−2会发生快速、剧烈的化学反应，导致NO−2快速消耗的同时，也有明显的NO−2产生，但消耗速率明显高于产生速率[8]。长期以来，受测定技术和研究方法的限制，NO−2同位素的组成难以准确测定。过去很长时间是通过氨基磺酸（NH3SO3H）去除NO−2后差减得到，误差很大[9]。Steven和Laughlin [10]首次以NO−2和NH2OH产生N2O为基础，实现了对0.5 μmol NO−2和5 μmol NO−3同位素组成的准确测定，但这一方法仅适用于标记样品，对自然丰度或低浓度标记样品测定误差较大；Silva等[11]提出离子交换法及封管燃烧法分析低丰度的样品，但只适用于淡水样品，不适用于土壤KCl提取液，且样品预处理繁琐、成本昂贵。McIlvin和Altabet [12]、Isobe等[13]、Lachouani等[14]、Tu等[15]利用镉/氯化钒和叠氮化物两步还原法，分别测定水体或土壤浸提液中低浓度NO−3和NO−2同位素组成，但存在N同位素分馏、O同位素与水交换现象，产生的HN3为剧毒物质。Sigman等[16]和Casiotti等[17]利用缺乏N2O还原酶的反硝化细菌将NO−3NO−2还原为N2O，实现对水体/土壤浸提液中的极低浓度NO−2/NO−3（1 μmol·L–1）同位素组成的测定，但是无法区分NO−2、NO−3，虽可用抗坏血酸分离NO−2，但操作步骤繁琐，且分离不完全[18]。Böhlke等[19]首次利用两种反硝化菌Stenotrophomonas nitritireducens和Pseudomonas aureofaciens，先专一还原NO−2为N2O，再还原NO−3为N2O，实现了同一水体样品中低浓度NO−2和NO−3（5 nmol N）同位素组成的准确测定，但是该方法操作较繁琐，培养周期长，是否适合土壤浸提液还未可知。

反硝化细菌法采用缺乏N2O还原酶活性的兼性反硝化细菌，将NO−3和NO−2还原为N2O[17]，而不产生N2。P. aureofaciens和P. chlororaphis是被广泛使用的两种反硝化细菌，用于测定水体样品的15N丰度测定，如淡水、地下水、沉积物孔隙水等，但它们无法区分NO−2和NO−3，而S. nitritireducens菌能专一还原NO−2，不与NO−3反应，曾被用于构建专一测定NO−2的微生物电极[20-21]，Böhlke等[19]首次将其用于测定水体样品中的NO−2同位素组成。与水体样品相比，土壤浸提液成分复杂，具较强缓冲能力[22]，含有大量可溶性颗粒物质[23]，而且不同类型的土壤样品差异大，在酸性土壤中NO−2极不稳定[7]。土壤浸提液含大量K+、Cl–，不但影响反硝化菌的转化能力，还存在杂质氮干扰测定[23-26]。所以，当前的反硝化细菌反应体系是否适合不同类型的土壤浸提液还需进一步验证。反硝化细菌法中菌体的反硝化能力直接影响NO−2/NO−3的转化率，为避免低转化率造成的同位素分馏，一般采用长时间厌氧/微氧培养（5~10 d）[19，26-27]，培养过程中不同批次的菌体差异往往很大。但目前使用的S. nitritireducens、P. aureofaciens和P. chlororaphis均为兼性菌，能同时适应厌氧和好氧条件，好氧条件下菌体生长迅速，改为好氧培养能有效缩短培养时间，是否对测定结果有影响还需探讨。反硝化反应的中止通常使用10 M NaOH，高浓度碱液产生的气体会腐蚀质谱仪器管路，中止后的样品需要在2 d内完成测定，对样品测定造成不便[16，28]。此外，与化学转化法相比，反硝化细菌法未被广泛采用的一个重要原因是，菌体培养过程存在诸多不稳定因素，直接影响测定结果的准确性[27]。处于不同生长期的菌体，其反硝化能力差异很大，对测定结果影响显著；同一批次的菌种，菌体浓度差异也会影响反硝化转化能力；厌氧培养菌体生长极为缓慢，难以控制菌体生长时期；长时间的厌氧培养还存在染菌风险。因此，如何有效减少这些不稳定因素，也是亟需解决的技术难题。

本研究在Böhlke等[19]的基础上，从缩短反硝化细菌的培养时间、提升菌体培养稳定性等入手，在培养方式、反应条件、保存方式上优化反硝化细菌法，结合土壤浸提液的特点旨在建立一套快速、准确、稳定测定土壤浸提液中NO−2的15N丰度的反硝化细菌方法体系。同时，使用优化后的方法测定了酸性、中性和碱性土壤浸提液中NO−2的15N丰度。

1 材料与方法 1.1 反硝化细菌法操作步骤

本文所用菌种为Stenotrophomonas nitritireducens（ATCC No. BAA-12），具体实验流程如下：2管种子液解冻15~30 min，无菌环境下接种至含100 mL培养基的250 mL三角瓶中，培养基成分为TSB（tryptic soy broth）（15.0 g·L–1），（NH4）2SO4（0.25 g·L–1）和KH2PO4（2.45 g·L–1），放入摇床（常州普天仪器制造有限公司，HZQ X160，HZQ F160）26 ℃、180 r·min–1好氧培养12~15 h。摇培好的菌液经9 800 r·min–1离心5 min，使用新鲜培养基重悬洗涤3遍，分装4 mL至22.5 mL的顶空样品瓶中，用丁基塞和旋口塑料盖密封后，使用高纯N2（99.999%）吹扫30 min。设置空白对照，分为仅菌液空白对照、菌液+1 mL超纯水/KCl溶液空白，其余含菌液瓶中加入1 mL 20 μmol·L–1的样品（20 nmol NO−2），待反应至少1 h后取气。抽取顶空瓶内12~14 mL气体，注入含1~2片NaOH固体的22.5 mL真空瓶中，补充高纯N2平衡压力，使用带微量气体预浓缩装置的同位素比值质谱仪（PreCon-GasBench-IRMS，Delta V Plus，Thermo Fisher Scientific）测定气体样品中的N2O的δ15N值，即为NO−2的15N丰度。

1.2 细菌培养条件优化

本实验使用的S. nitritireducens（ATCC No.BAA-12）购自美国菌种保藏中心（American type culture collection，USA）。将装有冻干粉的安瓿清洁后（75%乙醇），无菌环境下吸取0.2 mL无菌水溶解至悬浮状，接种环接至1~2个TSA（tryptic soy agar）平板培养基，适宜温度培养1~2 d，挑取单菌落转接培养第2代用作工作菌种保藏。

为保证不同批次菌体的稳定性、减少染菌风险、节约菌体前期生长培养时间，采用Weigand等[27]方法制备大量种子液冻存，以备多次实验需要。具体过程：工作菌种挑单菌落转接到含100 mL TSB培养基（tryptic soy broth）的500 mL三角瓶内，26 ℃、120 r·min–1好氧摇培21~22 h，此时菌种处于对数生长末期和稳定期，2 mL无菌离心管内加入500 μL无菌30%甘油和500 μL菌液，摇匀后–80 ℃冰箱冻存。

（1）接种方式的优化。对反硝化细菌S.nitritireducens的接种方式进行优化。在同批次内设置单菌落和种子液两种接种方式，各设置3个重复。单菌落接种需先在TSA（tryptic soy agar）平板上培养2~3 d，待成熟后挑单菌落至含100 mL培养基的250 mL三角瓶内，26 ℃、180 r·min–1好氧摇培12~15 h。种子液接种指从–80 ℃冰箱取出2管1 mL种子液，4 ℃解冻后转接至含100 mL培养基的250 mL三角瓶内，26 ℃、180 r·min–1好氧摇培12~15 h。使用实验室标样Lab-1作为样品，比较两种接种方式对其δ15N值的影响。

（2）培养方式的优化。在不同批次间设置微氧摇培和好氧摇培两种情况。微氧摇培参考Böhlke等[19]的实验，即取2管种子液加入含100 mL培养基的120 mL密封血清瓶中，留部分顶空，每天注入1 mL O2，26 ℃、120 r·min–1微氧摇培4~5 d，继而开展后续步骤。好氧摇培即取2管1 mL种子液接种至含100 mL培养基的250 mL三角瓶内，瓶口覆盖8层纱布，26 ℃、180 r·min–1好氧摇培12~15 h。使用实验室标样Lab-1作为样品，比较两种培养方式对其δ15N值的影响。

（3）反硝化细菌浓度优化。为考察反硝化细菌浓度对NO−2 - 15N同位素测定的影响，设立不同OD600值的菌体浓度，对标记丰度的实验室标准样品（KNO2-A、KNO2-B、KNO2-C）和自然丰度的国际标准样品（RSIL-N7373、RSIL-N10219、RSIL-N23）分别进行测定。菌体OD600值的测定方法如下：使用紫外分光度计调至波长600 nm进行测定，选取杯差接近的比色皿，以培养基作为空白对照并倒入菌液进行测定，可测3次值取平均。其中，第一批次菌体的OD600值分别为0.42、0.67、0.78、1.18，用于标记标准样品的测定；第二批次菌体OD600值分别为0.29、0.32、0.58、0.60、0.70、0.88、2.10，用于自然丰度的国际标准样品测定。

1.3 反应条件优化

（1）气体吹扫优化。反硝化细菌法需使用惰性气体吹扫创造厌氧环境，去除残留空白（NO−3、NO−2和N2O），本文对高纯He（99.999%）、高纯N2（99.999%）两种惰性气体吹扫进行比较。样品吹扫时使用5号长针头作为进气针，插入到液面以下，5号短针头作为出气针，不插入液面。为比较吹扫后培养基中残留空白的量及空白量是否对样品δ15N值产生影响，设置仅菌液（无样品）、1 mL超纯水+菌体、1 mL标准样品Lab-1+菌体，每组3个重复，吹扫后上质谱仪测定。

（2）气体保存优化。设置转移气体和不转移气体两种气体保存方式，各设置3个重复。转移气体处理需使用带锁帽的注射器从22.5 mL培养瓶顶空抽取约12~14 mL气体，转移至预先抽真空的含1~2片NaOH固体的22.5 mL顶空瓶中，补入14 mL高纯He保持正压状态。不转移气体处理是直接在含有样品和菌液的培养瓶中，使用带双套针的进样装置连接培养瓶，需当天在质谱仪上完成测样。

1.4 土壤浸提液NO−2的15N同位素测定

（1）不同浓度KCl对NO−2的15N同位素测定的影响。土壤浸提液中含大量K+、Cl–，可能影响NO−2的15N同位素比值分析。使用0.1 mol·L–1、0.5 mol·L–1、1 mol·L–1、2 mol·L–1的KCl配制Lab-1标准样品，溶液浓度为20 μmol·L–1，反硝化细菌法过程采用优化后的流程。每个标准品设4个重复，同时设置仅含菌体和0.1、0.5、1、2 mol·L–1 KCl的空白对照以及配制的三个国际标准样品，探究不同浓度KCl对反硝化细菌法的影响。

（2）不同土地利用类型土壤中NO−2的15N同位素测定。供试土壤为江西鹰潭森林土（28º14´N，117º13´E）、安徽安庆水稻土（30º52´N，117º05´E）、吉林长春水稻土（43º88´N，125º35´E）、广西桂林水稻土（25º27´N，110º29´E）、四川盐亭农田土（31º23´N，105º35´E），土壤晾干、过2 mm筛存于4℃冰箱。称取20 g干土，1 mol·L–1 KCl以5︰1（液：土）提取，250 r·min–1振荡30 min，悬液静置3~5 min后过滤待用。本文使用的KCl均在马弗炉烘450 ℃、48 h。此外，在使用反硝化细菌法测定土壤浸提液NO−2之前，先测定NO−2的浓度，其浓度极低、几乎低于检测限，因此在土壤浸提液中人为添加了20 nmol NO−2的Lab-1（理论丰度为–13.58‰）。在同批次内，样品设置如下：空白设置为菌液、1 mol·L–1 KCl，且使用1 mol·L–1 KCl配制三个标准样品RSIL-N7373、RSIL-N10219、RSIL-N23进行校正，并使用化学法进行验证。

1.5 样品溶液的配制

实验中所使用的同位素标样（表 1）有国际标准样品RSIL-N7373、RSIL-N10219、RSIL-N23（The Reston Stable Isotope Laboratory），也有实验室日常工作标样（国药分析纯）Lab-1、KNO2-A、KNO2-B、KNO2-C，在元素分析仪-同位素质谱联用仪测定后，用国际标准样品校准。反硝化法实验中，根据实验需要，所有标样均使用超纯水或0.1、0.5、1、2 mol·L–1 KCl配制为20 μmol·L–1的溶液。

表 1 本文使用的同位素标准样品 Table 1 Bulk isotopic data for materials used in this study
1.6 数据处理与校正

本文中测定得到的δ15N值均为相对于大气N2的δ15NAir，其中δ15N校正值为经国际标准品校正的值。文中数据处理采用Origin 9、SPSS 19.0统计分析，并采用t检验和方差分析法来检验差异显著性。

2 结果与讨论 2.1 培养条件的优化 2.1.1 接种方式的影响

分别使用单菌落、种子液两种接种方式培养S. nitritireducens，发现转化NO−2为N2O的效率及其δ15N值无明显差异，但种子液培养时间短，不同批次菌体浓度稳定、操作简便，且可降低染菌风险。结果显示，单菌落和种子液两种接种方式处理Lab-1标样后，产生N2O气体的m·z–1 44峰面积分别为16.78 V·s、16.44 V·s（图 1a），差异不显著（P > 0.05），可见两种接种方式的转化效率相当。两种方式产生N2O的δ15N值也无明显区别（P > 0.05），分别为–12.46‰、–12.34‰，与Lab-1在元素分析仪-同位素质谱联用仪上的测定结果（–13.58‰）较一致，种子液接种的SD值（0.29‰）略大于单菌落接种（0.03‰），与Böhlke等[19]报道的0.2‰~0.5‰相吻合。在培养时间上，种子液摇培0.5 d即可使用，而单菌落法需先在平板上培养1~2 d，再转接至液体培养基摇培2~5 d，操作繁琐，可能增加染菌风险。反硝化细菌的转化能力与菌体所处生长时期有关，而种子液接种能提高菌体的可控性和稳定性，减少不同批次间的菌种培养的差异。这一方法已被推荐用于P. aureofaciens和P. chlororaphis测定NO−3/NO−2的同位素组成[23]，虽然所使用菌体不同，但均能缩短实验周期、减少菌体培养不当产生的测定问题。

注：图中相同字母表示无显著差异（P > 0.05）。  Note：The same letter in the graph indicates no significant difference（P > 0.05）. 图 1 培养条件的优化对测定样品的峰面积对比（a）及好氧摇培S. nitritireducens的生长曲线（b） Fig. 1 Optimization of culture conditions on the comparison of peak areas of measured samples(a)and growth curves of aerobic shake culture of S. nitritireducens(b)
2.1.2 好氧培养的影响

微氧摇培和好氧摇培两种方式对Lab-1标样的δ15N值测定结果无显著差异（P > 0.05），分别为–12.34‰±0.29‰和–13.93‰±0.14‰，好氧摇培下的δ15N值更接近理论丰度且SD值更小。S. nitritireducens是兼性菌，好氧或厌氧条件均能生长，在厌氧条件下能保证菌体的反硝化能力，但菌体生长非常缓慢，好氧条件下菌体长势更好，在4~16 h能迅速到达对数生长期（图 1b）。Böhlke等[19]采用50 mL密封瓶添加35 mL培养基或160 mL密封瓶添加130 mL培养基，微氧培养菌体2~5 d（需每天补入O2）才能用于样品制备；好氧培养无需使用密封瓶，在250 mL三角瓶加入100 mL培养基，以八层纱布和报纸封口，摇培过夜（12~15 h），次日即可使用，耗时更短，操作更便捷。过去经常使用厌氧/微氧培养[16-17]的方法，是因为好氧培养难以激发菌体的反硝化能力，在使用P. aureofaciens测定NO−3的同位素比值时，发现培养环境中O2含量过高，虽然菌体生长迅速，但较高的菌体浓度造成NO−3转化速率变慢，反硝化产物以NO为主，N2O较少，会发生同位素分馏[26]。但对于兼性菌，在好氧培养后，通过一定时间吹扫高纯N2或He气体，可以促使菌体适应厌氧生长环境，激发反硝化能力，还能有效去除培养液中的残留NO−2或NO−3。近期也有报道对P. aureofaciens尝试好氧培养24 h，再通过长达3 h吹扫高纯N2，P. aureofaciens能迅速转化NO−3为N2O，反硝化能力不受影响，无同位素分馏现象，且大大缩短培养时间[29]。

2.2 反应条件的优化 2.2.1 气体吹扫的影响

反硝化细菌法测定NO−2/NO−3的同位素比值时，需吹扫惰性气体建立厌氧环境，同时去除培养基中残留的NO−3、NO−2和N2O，减少空白杂质对测定结果的影响[16，19]。通常选用高纯N2或He吹扫，在NO−3的测定上曾比较过两种气体，发现均可用于吹扫，测定结果主要受吹扫时间长短影响[25-27]。结果表明He和N2气体吹扫0.5 h对Lab-1标样的测定结果无显著差别（P > 0.05），分别为–12.37‰±1.11‰、–12.46‰± 0.03‰，与元素分析仪-同位素质谱联用仪的测定结果吻合。Böhlke等[19]使用高纯He吹扫0.5 h，在仅添加去离子水和菌液的空白对照中产生的N2O为0.05±0.04 nmol，实验使用高纯N2吹扫0.5 h后，空白对照产生的N2O峰面积≤0.5 V·s，而20 nmol NO−2样品产生的峰面积≥16.5 V·s，空白的峰面积不足0.3%，产生的N2O≤0.07 nmol。但是，在P. aureofaciens转化为NO−3时，高纯N2吹扫1.5 h后，空白占40 nmol NO−3样品的峰面积仍可达到7.96%，只有3 h或两次1.5 h吹扫后才能低于1%[29]。P. aureofaciens和S. nitritireducens使用的培养基成分类似，可能培养基中残留NO−3大于NO−2，需要充分吹扫去除，避免影响NO−3的测定，而S. nitritireducens专一利用NO−2，短时间吹扫即可。综上，在NO−2测定上，建议选择更为经济的高纯N2吹扫0.5 h。

2.2.2 气体保存方式的影响

反硝化菌法测定NO−3/NO−2时，在上机测定前需加入适量高浓度NaOH或KOH（10 M）中止反硝化反应，灭活样品带入的其他反硝化菌，防止N2O被还原为N2，并吸收培养时产生的CO2，避免干扰N2O的测定[16，19，27]。为避免碱液进入质谱仪器，进样时需额外添加消泡剂，但碱蒸汽仍会随N2O进入仪器腐蚀管路。本文发现直接转移N2O气体至抽真空干燥气瓶和不转移，对Lab-1样品中NO−2的δ15N值并无显著影响（P > 0.05），分别为–12.57‰±0.05‰、–12.34‰± 0.29‰，产生N2O气体的m·z–1 44峰面积分别为9.57 V·s、16.44 V·s，与不转移气体相比，虽然转移气体后峰面积下降了约1/2，但其δ15N值更接近样品理论丰度，SD值仅为0.05‰。过去通常不采用气体转移的方式，是由于N2O气体可溶于水，且顶空气体无法完全转移，可能发生同位素分馏[16，19，28，30]。但Morkved等[25]发现，反硝化细菌测定土壤样品的NO−3时，由于土壤中的NO−3浓度一般高于水体，在液体︰顶空 > 1︰5的培养瓶中，室温下转移气体产生的误差≤0.09‰，液体：顶空 > 1︰11时，误差≤0.05‰，均与理论丰度吻合良好，而本实验中使用的培养瓶的液体：顶空=1︰3.5，产生的误差仅为0.05‰，较不转移气体更接近样品理论丰度。事实上，在每批次的试验时均包括2个以上的标准品，标准品的操作与样品完全相同，即使有同位素分馏现象，也可通过标准品校正测定结果。本文中的不转移方式，并未使用McIlvin和Casciotti[28]的双套针优化装置，无法吹扫溶解于液体中的N2O，因此测定结果精密度和准确度略差于转移气体的方式，但是转移气体的另一优点是，可以长时间稳定保存样品6个月，灵活安排样品测定。

2.3 菌体浓度的影响

反硝化反应时菌体浓度的高低可能影响测定结果。分别对不同OD600值菌体进行两批次的实验结果显示（表 2），在第一批次中，OD600值变化范围为0.4~1.2，对三个标记标准样品的测定并没有显著差异（P > 0.05），因标样15N丰度较高，测定值和理论值存在5‰~15‰的差异，但差异比例均不超过5%，与理论值基本吻合，测定的精密度良好，标样KNO2-A（112.38‰）的SD值为0.1‰~0.6‰；标样KNO2-C（422.17‰）的SD值为2.3‰~2.7‰。在第二批次中，OD600值变化范围为0.2~2.0，对三个国际标准品的测定结果中除OD600= 2.10外，其余无明显差异（P > 0.05），尽管测定值与实际值仍有差异，但校正值与实际值基本一致，测定精密度好，RSIL-N7373的SD为0.09‰~0.56‰，RSIL-N10219的SD仅为0.04‰~0.13‰，RSIL-N23的SD为0.04‰~0.31‰。因此，OD600≤1.2的菌体浓度，可准确测定标记样品和自然丰度样品的NO−2-15N值，考虑到分光光度计的测定准确性，建议使用OD600=0.3~0.9的菌体浓度。

表 2 菌体OD600值对NO−2的δ15N测定值的影响 Table 2 Influence of OD600 value of bacteria on the δ15N determination of NO−2

已有研究表明，反硝化细菌法测定NO−3时，菌体浓度对其反硝化能力有很大影响，过高或过低菌体浓度均可能造成转化不彻底，产生同位素分馏[26-27，30]。菌体浓度主要与菌体所处生长时期有关，也和浓缩、稀释等操作有关，可通过OD600或OD550值表示。Zhu等[26]和Stock等[29]发现处于对数生长期的P. aureofaciens（≤5.6×108 cells·mL–1）才能保证反硝化效率，保持稳定的O同位素交换，而稳定期或衰亡期的菌体生理代谢减缓，反硝化能力下降。Zhu等[26]还指出反应体系里P. aureofaciens菌体数量不宜过高，否则转化速率明显下降，O同位素交换加剧，测定的精密度和准确度均降低。实验中S. nitritireducens摇培12~15 h后，菌体生长曲线显示进入对数生长期，菌体数量约为5.4×106 cells·mL–1，低于108 cells·mL–1。使用不同OD600值的对数期菌体与样品进行反应的结果也显示，过高的菌体浓度（OD600≥0.9）会造成转化效率下降，同位素分馏作用明显，影响测定结果。反应体系中的培养基仅为4 mL，过高菌体浓度会造成菌体之间竞争营养、生长不良，反硝化能力相应下降。与菌体计数相比，OD600测定操作简便，也能反映菌体的浓度高低，在不同批次的菌体培养中维持相似的OD600，还能保证批次间实验结果的稳定性。

2.4 土壤浸提液的优化 2.4.1 不同浓度KCl的影响

土壤浸提液中含有大量K+、Cl–，可能影响反硝化菌体活力，分别测定了0.1 mol·L–1、0.5 mol·L–1、1 mol·L–1、2 mol·L–1 KCl配制的Lab-1标样的δ15N值，发现除2 mol·L–1 KCl明显低于理论丰度（P < 0.05），其余均与理论值相近，测定的精密度良好。有研究表明KCl中含有杂质氮会干扰NO−3的测定[31]，本文使用的KCl事先经450 ℃高温灰化48 h，可去除大部分NO−2杂质，因此KCl空白对照（菌液+KCl）与纯水空白对照（超纯水+菌液）产生的N2O m·z–144峰面积相当，不超过样品峰面积的0.5%。也有研究指出高盐体系会抑制P. aureofaciens菌体活性，降低NO−3/NO−2转化速率，产生同位素分馏，δ15N值明显降低，因此KCl浓度不宜超过0.5 mol·L–1，建议使用0.25 mol·L–1[25-26，29]。但是，对S. nitritireducens，与0.1、0.5 mol·L–1 KCl相比，1 mol·L–1 KCl对其转化NO−2为N2O是有一定抑制作用，产生的N2O信号峰面积明显降低（图 2c），但δ15N测定值却无显著差异。传统方法通常使用2 mol·L–1 KCl或1 mol·L–1 CaCl2提取土壤中的无机氮，虽然有研究曾使用低至0.01 mol·L–1的CaCl2提取农田土壤[31]，但过低的KCl浓度可能影响提取效率，不同类型土壤差异很大，适合的KCl浓度也会有较大差异，所以建议使用不低于1 mol·L–1的KCl。对于2 mol·L–1 KCl配制的δ15N测定值（–17.58‰）虽然明显低于理论值，但在使用同浓度KCl配制的三个国际标准样品校正后，校正值和理论值基本一致（图 2b）。所以，在实际测定中，建议应使用和土壤样品同浓度的KCl配制标准样品，同时设置仅含KCl和菌液的空白对照，以此估算并校正KCl对测定结果的影响。

注：图中相同字母表示无显著差异（P > 0.05），不同字母表示差异显著（P < 0.05）。  Note：The same letter in the graph indicates no significant difference（P > 0.05），different letters indicate significant difference（P < 0.05）. 图 2 不同浓度KCl（0.1，0.5，1，2 mol·L–1）对样品NO−2的δ15N测定值（a）、δ15N校正值（b）和转化产生N2O峰面积（c）的影响 Fig. 2 Effect of different concentrations of KCl(0.1, 0.5, 1, 2 mol·L–1)on the δ15N determination(a), the δ15N correction(b)and the converted N2O peak area(c)of the sample NO−2
2.4.2 不同土地利用类型土壤浸提液的测定

使用上述优化后的反硝化细菌法反应体系，测定不同pH的农田、水稻、森林土壤中NO−2的15N丰度，发现测定结果与化学转化法无明显差异（P > 0.05），且反硝化细菌法的SD值基本小于化学转化法。由于试验土壤中的NO−2浓度极低，人为添加了20 nmol NO−2（理论15N丰度为–13.58‰），结果显示，测定值均接近添加NO−2的理论丰度。本次供试土壤包括了碱性紫色土和酸性森林土、水稻土，其中酸性土壤常有报道显示其NO−2较不稳定、难以测定，但使用优化后的反硝化细菌反应体系得到的测定结果稳定、准确。

表 3 不同土地利用类型土壤NO−2的15N丰度测定结果 Table 3 Results of 15N abundance measurements for different types of land use soil NO−2
3 结论

本文针对S.nitritireducens能专一还原NO−2为N2O这一特性，在Böhlke等基础上从培养方式、反应条件等方面进行优化，使其能实现对土壤浸提液中NO−2的15N丰度的快速、准确、稳定测定。优化后的菌体培养方式为种子液接种后，好氧摇培12~15 h，即可获得处于对数生长期的菌体，调节反应体系中的菌体OD600值为0.3~0.9，可保证菌体反硝化能力稳定，减少不同批次间的差异，且实验周期缩短为1~1.5 d。反应结束后，转移气体至真空气瓶，不影响测定结果的准确性和精密度，还能延长样品保存时间，减少碱蒸汽腐蚀仪器管路。使用高纯N2代替高纯He吹扫样品0.5 h，既可节约成本，又能创造厌氧环境、去除杂质氮。使用不超过1 mol·L–1的KCl浸提土壤，保证提取效率的同时，也能减少高盐对菌体活力的影响。对酸性、中性、碱性不同类型土壤，其20 nmol NO−2的15N丰度测定δ15N值的精度为0.1‰~0.9‰，测定结果准确可靠。

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表 1 本文使用的同位素标准样品 Table 1 Bulk isotopic data for materials used in this study
注：图中相同字母表示无显著差异（P > 0.05）。  Note：The same letter in the graph indicates no significant difference（P > 0.05）. 图 1 培养条件的优化对测定样品的峰面积对比（a）及好氧摇培S. nitritireducens的生长曲线（b） Fig. 1 Optimization of culture conditions on the comparison of peak areas of measured samples(a)and growth curves of aerobic shake culture of S. nitritireducens(b)
表 2 菌体OD600值对NO−2的δ15N测定值的影响 Table 2 Influence of OD600 value of bacteria on the δ15N determination of NO−2
注：图中相同字母表示无显著差异（P > 0.05），不同字母表示差异显著（P < 0.05）。  Note：The same letter in the graph indicates no significant difference（P > 0.05），different letters indicate significant difference（P < 0.05）. 图 2 不同浓度KCl（0.1，0.5，1，2 mol·L–1）对样品NO−2的δ15N测定值（a）、δ15N校正值（b）和转化产生N2O峰面积（c）的影响 Fig. 2 Effect of different concentrations of KCl(0.1, 0.5, 1, 2 mol·L–1)on the δ15N determination(a), the δ15N correction(b)and the converted N2O peak area(c)of the sample NO−2
表 3 不同土地利用类型土壤NO−2的15N丰度测定结果 Table 3 Results of 15N abundance measurements for different types of land use soil NO−2
反硝化细菌法测定土壤NO−2−15N丰度的方法优化
郭茹, 温腾, 曹亚澄, 张金波