氧化亚氮（N₂O）在大气中存留时间长且破坏臭氧层，是仅次于二氧化碳（CO₂）和甲烷（CH₄）的第三大温室气体。尽管大气中N₂O的浓度较CO₂低约1 000倍，但是相同浓度的N₂O的增温潜势约为CO₂的298倍，对全球总辐射强度的贡献约占6%^[1]。N₂O在大气存留的时间为116 ± 9 a^[2]，且能消耗大气层中的臭氧，对高空平流层的臭氧层造成损害^[3]。2018年大气中N₂O浓度与1750年的N₂O浓度相比增长超过20%，且在过去五年里大气中N₂O排放量增长率最高^[4]。2000年以来，全球N₂O的实际排放量超过了联合国政府间气候变化专门委员会（IPCC）的第五次评估报告中最高的典型浓度路径^[5]，也高于第六阶段耦合模式比较计划（CMIP6）中的所有共享社会经济路径^[6]，超出预期的N₂O排放对于实现《巴黎气候协定》的目标带来了更大的挑战^[7]。2007—2016年间全球N₂O总排放速率为17.0 Tg·a^–1（以N计，下同），N₂O大气化学汇为13.5 Tg·a^–1，源与汇间的不平衡造成大气N₂O浓度不断增加。N₂O的来源分为自然来源与人为源。自然源N₂O排放主要来自土壤和海洋^[7]，土壤N₂O排放占全球N₂O总排放的56%~70%^[8]。人为源的N₂O主要来自农田施肥、畜牧业生产、化石燃料和工业排放。其中农业排放的N₂O约占全球人为排放N₂O的52%，是大气中N₂O浓度升高的主要驱动力^[7]。随着全球人口不断增长和土地利用集约化，氮肥用量不断增加。大量施入氮肥的农业土壤N₂O排放量占全球陆地排放的30%^[8]。因此，农业土壤源N₂O是其重要来源，减少农业土壤N₂O排放的需求十分迫切。

目前，已经有一些农业土壤N₂O减排的措施和技术的相关研究，主要集中在氮肥类型、氮肥用量、添加农业化学品以及改进农业管理措施等^[9-12]。这些减排措施和技术的成功取决于对N₂O产生和还原微生物特别是参与硝化和反硝化过程的微生物的深入了解，以及在此基础上对关键微生物过程的调控。最新研究表明，直接应用N₂O还原微生物可减少农业土壤N₂O的排放^[13-16]。本综述主要总结农业土壤N₂O的生物源与汇、应用微生物减少农业土壤N₂O排放的方法、机制及调控等。

土壤N₂O的产生和消耗涉及复杂的微生物过程^[17]。产生N₂O的主要微生物过程包括氨氧化和硝化细菌反硝化、亚硝酸氧化、异养反硝化、厌氧氨氧化和硝酸盐异化还原成铵等途径^[18-19]。不同过程对N₂O净排放的相对贡献变化受微生物群落和环境条件的影响。土壤微生物参与的硝化过程和反硝化过程产生副产物N₂O，是农业土壤N₂O排放最为重要的来源^[18-20]。硝化过程包括两个阶段：（1）氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）将氨（NH₃）氧化为亚硝酸盐（$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $），其中间产物包括羟胺和一氧化氮（NO）；（2）亚硝酸盐氧化菌（NOB）将$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $氧化为硝酸盐（$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $）^[21]。AOB和AOA对全球N₂O排放具有很大的贡献，但它们产生N₂O的机制有所不同^[22]。AOB在低氧状态下可进行硝化反硝化，通过酶促反应将$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $通过NO还原为N₂O，或者将羟胺厌氧氧化为N₂O^{[21, 23]}。AOB和AOA可通过代谢中间产物（羟胺、NO和$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $）的非生物反应产生“杂化”的N₂O^[24-25]。AOA还可通过酶促反应将NO还原为N₂O，但是该反应的发生需要相对极端的环境条件^[26]。近些年，有研究发现一种能将NH₃完全氧化为$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $的完全氨氧化菌（comammox），可通过其中间产物羟胺的非生物反应产生N₂O^[27]。完全反硝化过程包括四个反应过程^[28]：（1）周质的硝酸还原酶（NAP）或者膜结合硝酸还原酶（NAR）催化$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $还原为$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $；（2）$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $被nirS/K编码的亚硝酸还原酶（NIR）催化还原为气体NO；（3）一氧化氮还原酶（NOR）催化NO还原为N₂O；（4）nosZ基因编码的N₂O还原酶（N₂OR）催化N₂O还原为N₂。约有三分之一含有nirS/K的反硝化微生物缺少nosZ基因^[29]，故而无将N₂O还原为N₂的能力，因此生成副产物N₂O。如反硝化细菌根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens C58含有nap、nir和nor基因，但缺少nosZ基因，在反硝化条件下产生N₂O^[30]。此外，产生N₂O的过程还包括生物与非生物耦合的化学反硝化过程（chemodenitrification）。例如，铁还原细菌将三价铁离子（Fe³⁺）还原成亚铁离子（Fe²⁺），亚铁离子再与亚硝酸盐发生化学反应生成N₂O^[31]。

具有nosZ基因的反硝化细菌（即N₂O还原细菌）将N₂O还原为N₂，是目前已知唯一的汇^[18-19]。N₂O还原细菌具有编码N₂OR的nosZ基因，产生的N₂OR将N₂O还原为N₂。不同的反硝化细菌还原N₂O的速率不同^[32]。因此，反硝化细菌群落的组成会影响N₂O的净排放速率。N₂O还原细菌有两种不同的类群，分别为典型的反硝化细菌（Clade Ⅰ）和非典型的反硝化细菌（Clade Ⅱ）。典型的反硝化细菌主要分布于α-、β-和γ-变形菌门（Proteobacteria）。非典型的反硝化细菌种类更为丰富多样，其中大多仅含有nosZ基因，不含其他反硝化基因；无产生N₂O的能力，仅消耗N₂O，为N₂O重要的汇^[33-34]。在多数环境下非典型的反硝化细菌nosZ Ⅱ基因丰度大于典型的反硝化细菌nosZ I基因丰度^[35-36]。随着已测序的微生物基因组种类和数目的增加，Jones等^[35]研究发现这两类N₂O还原微生物的多样性较先前预期的要大。每个类群的丰度或多样性不同，可能会对土壤N₂O排放产生重要影响^[37]。土壤N₂O汇的能力主要由含有nosZ Ⅱ基因的微生物决定，这些非典型的反硝化细菌nosZ Ⅱ基因多样性或丰度增加，可能会强化N₂O消耗或降低N₂O净排放量^[30]。Clade Ⅰ和Clade Ⅱ型N₂O还原细菌分布受土壤生物因子和非生物因子影响^[37]。含有nosZ I基因的细菌在植物根部占主导地位，而含有nosZ Ⅱ基因的细菌在土壤中占主导地位^[38]。分离、筛选和获得N₂O还原细菌对实现微生物介导的农业土壤N₂O减排具有重要意义。

N₂O减排微生物是指具有减少土壤N₂O排放功能的一类微生物：可以是微生物本身具有合成活性N₂OR的nosZ基因的N₂O还原细菌，也可以是具有土壤N₂O减排效应但不含nosZ基因的植物根际促生菌，或可以是其他具有土壤N₂O减排效应的微生物；可以是细菌，也可以是真菌。现有的N₂O还原细菌一般为反硝化细菌。最近，Ashida等^[39]已通过功能性单细胞分离方法从水稻田中分离出数千株典型的反硝化菌株，其中许多是N₂O还原细菌^[40]。Ishii等^[40]从日本水稻土中分离获得含有nirS和nosZ基因的N₂O还原细菌Burkholderia sp. TSO47-3，其还原$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $和$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $的反硝化活性极低，但具有很强的N₂O还原活性。Tago等^[41]从日本不同水稻土和水稻-大豆轮作土壤中分离获得的反硝化细菌Azoarcus sp. KS11B和Niastella sp. KS31B的反硝化终产物仅有N₂，它们还具有还原外源N₂O的能力。Gao等^[42-43]进一步从日本不同地区水稻土中分离获得的N₂O还原细菌中，筛选获得具有良好促生特性的植物根际促生菌固氮螺菌属菌株Azospirillum sp. TSA2S、A. sp. TSH100和新草螺菌属菌株Novoherbaspirillum sp. UKPF54。大豆慢生根瘤菌Bradyrhizobium japonicum USDA110是与大豆共生的固氮菌，含有napDABCDE、nirK、norECBQD和nosRZDFYLX基因，其反硝化终产物仅有N₂^[44]。Itakura等^[15]在纯培养条件下发现了较B. japonicum USDA110具有更高N₂OR活性的B. japonicum 5M09自然突变菌株和B. japonicum PRNOS基因工程突变菌。刘春梅等^[45]从水稻土中分离筛选出一株兼性N₂O还原菌，含有narG、nirS、cnorB和nosZ基因，其在厌氧条件下还原外源N₂O速率高达0.0219 μmol·min^–1，表现出较强的还原能力。Domeignoz-Horta等^[46]发现含有nosZ Ⅱ基因的非典型反硝化细菌发酵成对杆菌Dyadobacter fermentans NS114^T，该菌株在纯培养条件下仅还原N₂O，不能以其他形式的氮氧化物为电子受体。近些年，具有还原N₂O能力的微生物相继被发现分离，增强它们在土壤中的丰度和活性是减少土壤N₂O排放的关键^[47]。

直接应用微生物减排土壤N₂O的策略分为三种。第一种策略是将制备的微生物菌剂直接施用到土壤。Domeignoz-Horta等^[46]在土壤微宇宙条件下将D. fermentans NS114^T扩繁后接种至11种不同类型的土壤中，超过1/3的土壤反硝化终产物比值rN₂O/r（N₂O+N₂）显著降低；接种较高浓度的D. fermentans NS114^T在有些土壤上具有更强的N₂O减排效果。Itakura等^[15]在盆栽试验条件下将含有nosZ基因的B. japonicum USDA110接种至种植大豆幼苗的土壤中，接种30 d后移除大豆幼苗地上部，测定大豆根际系统的N₂O排放，发现USDA110菌株显著减少了大豆根际系统中N₂O的排放；在接种具有更高N₂OR活性的B. japonicum 5M09自然突变菌株时具有更好的N₂O减排效果。将B. japonicum 5M09和含有nosZ基因的B. japonicum Tsu125接种至种植有大豆种子的育苗土壤中，再移栽至田间土壤，发现菌株5M09和Tsu125极大减少了N₂O累积排放量^[15]。Gao等^[14]在温室盆栽试验条件下向种植红花苜宿和梯牧草的土壤分别接种7株具有植物促生效应的N₂O还原细菌，大部分菌株可促进牧草植物氮磷养分的吸收，同时具有减排牧草土壤N₂O和促进牧草植物生长的双重效应。除了接种N₂O还原细菌，极个别具有植物促生效应的非N₂O还原微生物也可减少农业土壤N₂O的排放^[48-49]。Calvo等^[50]在温室盆栽试验中将四种植物根际促生菌Bacillus spp.混合培养后接种至施肥后的土壤中，减少了土壤N₂O排放以及促进玉米的生长和氮素吸收。Wu等^[48]在温室盆栽试验条件下将植物根际促生菌解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens EBL11接种至施肥后的酸性土壤，在明显促进了油菜生长的同时，减少了酸性茶园土壤N₂O排放。Xu等^[49]在温室盆栽试验中将植物促生真菌Trichoderma viride EBL13接种至施肥后的茶园土壤，使得茶园土壤N₂O的排放减少了67.6%。

第二种策略是将制备的微生物菌剂与肥料或其他载体等结合后施入土壤。Nishizawa等^[16]在微宇宙条件下，将Azoarcus sp. KS11B、Niastella sp. KS31B和Burkholderia sp. TSO47-3等三株N₂O还原细菌与颗粒有机肥混合后施入土壤中，与施加颗粒有机肥但未接种处理相比，均显著减少了土壤N₂O累积排放量，分别降低了63.0%、61.3%和43.8%。Gao等^[13]在田间原位条件下，向火山灰土和冲积土中施入分别接种N₂O还原细菌Azospirillum sp. TSH100和Novoherbaspirillum sp. UKPF54的颗粒有机肥，均有效减少了这两种农田土壤的N₂O累积排放量。Xu等^[51]利用甘薯淀粉废水将绿色木霉菌Trichoderma viride EBL13大量扩繁后，以秸秆为载体经固态发酵生产生物肥料，施入田间原位的茶园土壤，与施用等氮量的化学肥料相比，生物肥料处理增加了茶园茶叶产量，同时茶园土壤N₂O排放量显著减少了33.3%~71.8%；与施用含氮量高一倍的化学肥料处理相比，生物肥料处理未减少茶叶产量且N₂O排放量显著降低了71.6%；表明该生物肥料不仅可保持作物产量，还可提高氮肥的利用率以及减少氮肥用量。

第三种策略是构建具有N₂O减排效应的微生物菌群，然后制备成菌剂直接施入土壤或与肥料等载体结合后再施入土壤。为了增强在田间原位条件下接种微生物的减排效应及与土著微生物的竞争力，Akiyama等^[52]筛选了63种含有nosZ基因的土著B. diazoefficiens菌株，将它们混合培养后接种至田间大豆根际土壤。结果表明，与未接种处理相比，接种B. diazoefficiens菌群在未影响根瘤数量的情况下显著增加了含有nosZ基因的根瘤比例，而且根瘤分解时期的N₂O排放量显著降低。

除直接应用微生物减排土壤N₂O之外，还可通过改变农业管理措施（耕作制度、灌溉方式和作物轮作系统等）和添加农业化学品（生石灰、生物质炭和硝化抑制剂等），也可以刺激N₂O还原菌生长。Grave等^[53]发现在施入氮肥的情况下，与常规耕作相比免耕会增加农田土壤N₂O的排放。Vázquez等^[54]使用实时荧光定量PCR方法研究耕作制度对地中海土壤微生物群落的影响，发现常规耕作与免耕相比增加了nosZ基因丰度。Harter等^[55]证明生物质炭可通过增加nosZ基因的丰度和转录水平来增强N₂O的还原，从而减少土壤N₂O的排放。

由此可见，应用微生物减排农业土壤N₂O的技术切实可行。应用具有N₂O减排效应的植物根际促生菌不仅能够减少农业土壤N₂O排放，还能够减肥增效、促进作物生长（表 1）。明确应用微生物减少农业土壤N₂O排放的微生物生态学机制，将有助于定向调控农业土壤N₂O排放，构建基于微生物的新型N₂O减排技术。

表 1 Table 1

表 1 N2O减排微生物对农业土壤N2O排放和作物产量的影响 Table 1 Generalized overview of the effects of microorganisms on N2O emission reduction and crop yield 菌株 Microbial strain nosZ基因 nosZ gene 来源 Source 供试体系 Test system N2O减排1） N2O emission reduction /% 土壤特征 Soil feature 作物2） Crop 参考文献 References N2O还原细菌N2O-reducing bacteria Azoarcus sp. KS11B 有 水稻土 微宇宙试验 63# 冲积土 无 [16] Niastella sp. KS31B 有 水稻土 微宇宙试验 61# 冲积土 无 [16] Burkholderia sp. TSO47-3 有 水稻土 微宇宙试验 44# 冲积土 无 [16] Dyadobacter fermentans NS114T 有 表面灭菌的玉米茎 微宇宙试验 51^ 耕地和牧草地 无 [46] Azospirillum sp. TSH100 有 水稻土 盆栽试验 田间试验 76# 37# 冲积土 冲积土 红花苜蓿+ 无 [14] [13] Novoherbaspirillum sp. UKPF54 有 水稻土 盆栽试验 田间试验 832# 233# 冲积土 火山灰土 红花苜蓿+ 无 [14] [13] Bradyrhizobium japonicum USDA110 有 大豆根瘤 盆栽试验 832# 火山灰土 大豆 [15] Bradyrhizobium japonicum 5M09 有 自然突变 盆栽试验 田间试验 892# 563# 火山灰土 火山灰土 大豆 大豆 [15] [15] 非N2O还原细菌Non-N2O-reducing bacteria Bacillus amyloliquefaciens EBL11 无 水稻根际 盆栽试验 432* 红壤 油菜+ [48] Trichoderma viride EBL13 无 土壤 盆栽试验 田间试验 682* 33-723* 红壤 红壤 蕹菜 茶树+ [49] [51] 注：1）N2O减排（#）累积排放量，（^）N2O产生潜势，（*）N2O排放通量。2）作物情况：（+）表示作物生物量或产量增加。 Note：1）N2O emission reduction：（#）cumulative N2O emission，（^）potential N2O production rate，（*）N2O emission. 2）Crop situation：（+）indicates crop biomass or crop production increased.

表 1 N2O减排微生物对农业土壤N2O排放和作物产量的影响 Table 1 Generalized overview of the effects of microorganisms on N2O emission reduction and crop yield

应用微生物减排N₂O的直接机制是指人为向土壤中接种的微生物本身具有还原N₂O的功能，能合成有活性的N₂OR，并将N₂O还原为N₂，从而促使农业土壤N₂O的减排（图 1a）。具有直接减排N₂O功能的微生物通常是指具有nosZ基因的N₂O还原细菌。N₂O还原细菌减少N₂O排放的作用机制有两种：一种是接种的N₂O还原细菌在与土著反硝化微生物竞争电子供体（有机化合物）和电子受体（$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $和$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $）中占主导地位，使得土著反硝化微生物的反硝化活性降低；另一种是接种的N₂O还原细菌不影响土著反硝化微生物产生N₂O的过程，而合成大量有活性的N₂OR将N₂O还原为N₂；也可能二种机制同时存在。Akiyama等^[52]利用实时荧光定量PCR技术证明在田间试验条件下向大豆根际土壤中接种含有nosZ基因的B. diazoefficiens菌群显著增加了nosZ基因的表达，nirK基因的表达无显著变化但略有下降。这种现象说明B. diazoefficiens菌群还原N₂O的两种作用机制。Domeignoz-Horta等^[46]在微宇宙试验中向瑞典耕作土壤中接种含有nosZⅡ基因的D. fermentans NS114^T，同时显著减少了N₂O产生潜势和N₂O排放潜力，而且其反硝化潜势无显著变化，表明接种的D. fermentans NS114^T可消耗土壤中其他微生物产生的N₂O，说明了N₂O还原细菌减少N₂O排放的第二种作用机制。

图 1 微生物介导的农业土壤N2O减排的微生物生态机制（a. 直接机制；b. 间接机制） Fig. 1 Two microbial ecological mechanisms of using microorganisms mediated N2O mitigation from agricultural soils(a. direct mechanism; b. indirect mechanism)

接种微生物减排N₂O的间接机制是指人为向土壤接种非N₂O还原细菌，通过改变土著N₂O还原细菌群落的组成和丰度以及代谢活性，促使农业土壤N₂O的减排（图 1b）。非N₂O还原细菌虽然无编码N₂OR的nosZ基因，但仍具有减排N₂O的能力^{[48-49, 56]}，其可能的减排机制是非N₂O还原细菌改变了土壤微生物的群落组成。例如，Bacillus spp.是广泛使用的植物根际促生菌，可产生多种抗病毒、抗细菌和抗真菌化合物来抑制病原微生物，但也对土壤中其他微生物产生影响^[57]。Wu等^[48]将典型的植物根际促生菌Bacillus amyloliquefaciens EBL11接种至施肥后的酸性土壤，通过qPCR技术对功能基因amoA（AOA和AOB）、nirK、nirS和nosZ进行定量分析，结果表明接种B. amyloliquefaciens EBL11后AOB丰度降低，同时显著增加了nosZ基因丰度。基于16S rDNA测序结果预测土壤中微生物功能基因组成和丰度的变化，发现接种B. amyloliquefaciens EBL11后氨氧化过程中的功能基因丰度减少，而N₂O还原过程中的功能基因丰度增加。上述研究结果表明B. amyloliquefaciens EBL11减少土壤N₂O排放的机制可能有两种：一种是通过减少土壤中AOB的数量来减少硝化作用下N₂O的产生；另一种是通过增加N₂O还原细菌数量或活性来增强N₂O还原过程；也可能二种机制同时存在。即B. amyloliquefaciens EBL11改变了土壤中氨氧化微生物和N₂O还原细菌群落的组成和丰度以及代谢活性。另一研究^[58]在温室条件下向施肥后的茶园土壤接种T. viride EBL13，与未接种处理相比N₂O排放减少了67.6%，然后通过qPCR定量和功能基因nosZ高通量测序研究T. viride EBL13与N₂O还原之间的潜在机制：T. viride EBL13可以提高植物的抗病性及抗胁迫能力，且定殖根部后可改变植物的基因表达；接种T. viride EBL13处理与未接种处理相比nosZ基因丰度和α多样性增加，表明T. viride EBL13增加了土著的N₂O还原细菌群落的丰度和多样性。这种差异可能是接种T. viride EBL13显著减少土壤N₂O排放的原因。

N₂O还原为N₂的生物过程受诸多环境因子的影响，主要包括$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $和碳源的可利用性、氧气（O₂）的浓度、水分含量、温度、pH和铜（Cu²⁺）浓度，其中pH和Cu²⁺浓度是影响N₂OR活性的两个最为关键的因素^{[19, 59]}。近年来，硫化物对N₂O还原过程的影响逐渐受到关注，有研究发现硫化钠的添加显著抑制N₂O还原^[60]。

$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $通常会抑制或延缓N₂O的还原，导致N₂O的排放增加^[61]。Senbayram等^[62]在微宇宙条件下发现在一定浓度下反硝化过程中N₂O/（N₂O+N₂）的比值随着$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $浓度的增加而升高，直至$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $浓度为10 mmol·L^–1时达到最大，表明在$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $浓度较高时反硝化细菌的N₂O还原过程受到抑制。Highton等^[63]同样发现N₂O还原活性对$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $+$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $浓度很敏感，在其浓度高时N₂产生速率较低。

碳源通过增强土壤异养微生物的呼吸（营造厌氧条件）和为反硝化细菌提供电子而促进反硝化过程，是反硝化过程的主要限制因素。反硝化过程中N₂O的积累可能是不同的N-还原酶之间的电子竞争引起的。有研究^[64]表明在废水处理中，浓度低的可利用碳源导致N₂O与上游N-还原酶之间的电子竞争，从而导致N₂O的瞬时积累。添加碳源通常可降低反硝化过程中N₂O/（N₂O+N₂）的比值，但是会受到$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $浓度和碳源种类的影响^[62-65]。

在纯培养和土壤微宇宙条件下，nosZ基因的表达受到O₂的抑制，与其他反硝化基因的表达（如nirS、nirK、cnorB和narG）相比，nosZ基因的表达对O₂更敏感^[66]。Morley等^[67]的研究证明N₂OR突然暴露于O₂时会暂时被抑制，但反硝化过程中其他的还原酶仍可发挥作用，结果导致N₂O的积累。

土壤水分含量是土壤N₂O排放的主要驱动力之一。土壤水分含量不仅决定了O₂的有效性，同时影响养分在土壤基质中的扩散和运输以及微生物细胞的代谢活性^[68]。当土壤水分含量达到饱和或含量较高时，O₂浓度相对较低，N₂O的扩散速率也相对较低，为完全反硝化过程提供了有利的环境条件；而土壤水分含量较低时，O₂浓度较高，不完全厌氧条件不仅使得反硝化微生物优先利用$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $和$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $，还抑制了N₂OR的活性^[63]。

温度对土壤N₂O排放同时表现出直接作用和间接作用。直接作用表现为：在一定温度范围内，随着温度的升高，土壤微生物活性和N₂O产生与还原过程中的酶活性增加，对土壤N₂O排放具有倍增效应^[18]。间接作用表现为：温度升高引起的土壤呼吸增加导致土壤O₂浓度降低，为反硝化细菌创造了厌氧条件。

土壤pH是控制N₂O排放的重要因素。在土壤pH5~8范围内，N₂O/（N₂+N₂O）的比值与土壤pH呈显著负相关^[69]。低pH影响细胞周质中N₂OR的组装或折叠，使其不能正确装配从而活性很低甚至无活性。向酸性土壤中施加生石灰可以中和土壤酸性，从而通过减少土壤中$ {\text{NO}}_{\text{2}}^ - $积累和促进完全反硝化过程来减少N₂O的排放^[54]。土壤pH的管理可能是未来减少农田土壤N₂O排放的重要策略，特别是对于过度施肥导致土壤酸化的地区。

Cu的生物可利用性是决定N₂OR活性的重要因素。依赖Cu²⁺的N₂OR由两个亚基组成，每个亚基包含一个双核Cu_A中心（电子传递结构域）和一个独特的四核Cu_Z中心（催化结构域）^[70]。典型的反硝化细菌在纯培养条件下，缺少Cu²⁺会导致nosZ基因表达水平降低^[71]或者N₂OR的合成受阻^[59]，进而N₂O不能被还原，导致大量N₂O产生。在土壤生态系统中，施入添加Cu²⁺的颗粒有机肥增强了反硝化细菌将N₂O还原为N₂的能力，减少了土壤N₂O的排放^[72]。因此，N₂OR的合成依赖N₂O还原细菌的生存环境中有足够的可利用性Cu。

尽管利用微生物减少农业土壤N₂O排放取得了一定的进展，但是该生物减排方法仍然有以下难点与问题，制约着微生物介导的土壤N₂O减排技术的高效设计和应用。

目前仅分离获得少量N₂O减排微生物。N₂O还原细菌种类丰富多样，很难将信息从有限的生理学研究推广至整个N₂O还原细菌群落，也很难将实验室研究结果类推至土壤生态系统。此外，在实验室条件下单个模型菌株的行为与其在自然环境中的行为也可能不尽相同。因此，尽管有些N₂O还原细菌在纯培养条件下具有高效减排N₂O的能力，但将它们接种至一个新环境后其还原N₂O的能力可能发生改变，阻碍在生态系统水平上精确预测或调控nosZ基因的表达和N₂OR活性。例如：Gao等^[13]从纯培养条件下筛选出38株具有较高N₂O还原活性的反硝化细菌，经过接种到有机肥和土壤微宇宙土壤进一步筛选，最终获得两株在田间原位条件下有效减少农业土壤N₂O排放的高效N₂O还原细菌。

自然界中的微生物群落是复杂且动态变化的，它们具有高度互联的代谢和生态互作网络^[73]。将微生物接种至存在生存竞争的土壤环境中，接种的微生物在与土著微生物的竞争中能否存活与定殖对其执行减少土壤N₂O排放功能起着决定性作用。例如：由于接种的根瘤菌与土著根瘤菌之间存在竞争，在土壤中存在土著根瘤菌的情况下，通常接种的高效根瘤菌无法发挥作用^[74]。因此选择接种的微生物时，菌株的竞争力已被认为是需要考虑的关键特征^[75]。

自然环境中复杂的微生物群落很难在实验室条件下再现^[73]。因此，在实验室条件下难以准确预测接种的微生物在自然环境中基因表达调控和功能的变化，以及对土著微生物群落组成和生态功能的影响。植物根际促生菌可分泌多种化合物，有些化合物可以调控植物基因的表达；此外，这些化合物也对土壤中其他微生物产生一定的影响。例如，Wu等^[48]通过高通量测序发现向土壤中施用含有B. amyloliquefaciens EBL11的生物肥料相对于施用化肥显著改变了土著的氨氧化微生物和反硝化细菌的群落组成和丰度，对其他关键土著微生物群落组成和生态功能的影响尚有待进一步探究。

接种的微生物减少N₂O排放功能的发挥通常受到多个因素的限制，除存在竞争性的土著微生物，还包括环境条件、农业管理措施、接种微生物本身以及接种方法等因素。N₂O还原为N₂的生物过程本身受诸多环境因子的影响，pH和Cu²⁺浓度是决定N₂OR活性的两个关键因素^[76]。例如，Shen等^[72]发现与未接种且未添加Cu²⁺的土壤相比，在火山灰土和灰色低地土中施入添加适宜浓度CuSO₄的颗粒有机肥后，再接种Azospirillum sp.UNPF1会显著降低两种土壤的N₂O累积排放量。即：向土壤中添加Cu²⁺后优化了接种N₂O还原细菌的环境条件。然而，采用Cu²⁺调控N₂OR活性措施在Cu²⁺缺乏的土壤中可能起到较好的效果，在Cu²⁺富集的土壤背景条件下，高浓度Cu²⁺可能抑制N₂O生成的微生物活性进而表现为减少N₂O的排放^[72]。此外，长期向土壤中添加Cu²⁺可能引起铜的累积量超过环境标准，导致土壤污染，同时危害植物、动物和人类健康^[72]。在施用动物源的有机肥和/或在Cu²⁺浓度较高的土壤中，特别需要注意这一点。分别采用土壤接种和有机肥接种时，Burkholderia sp. TSO47-3对土壤N₂O的减排效应有显著区别^[16]。Akiyama等^[52]改进发芽和接种方法后含有nosZ基因的根瘤比例大大提高。由此可见，优化的接种模式可能是调控微生物菌减排功能发挥的有效措施。

合适的定量模型可最终明确生态系统中微生物群落潜在的生态相互作用及其宏观效应^[73]。土壤N₂O产生和消耗的微生物生态学机制可能会在模型中得到实际体现，可将接种的微生物作为因子参数化来评估减排效果。但是要在广泛的气候条件、农业管理措施和土地利用类型中建立一套“微生物N₂O排放因子”，将大大增加参数的数量和模型的复杂性，非常具有挑战性^[19]。

本综述主要总结了基于微生物的新型N₂O减排方法。增强微生物作为N₂O汇的功能对于减少农业土壤N₂O排放至关重要。利用N₂O还原细菌或者具有N₂O减排功能的植物根际促菌可高效减少土壤N₂O排放，但涉及的微生物生态学机制有所不同。利用N₂O还原细菌减少农业土壤N₂O排放的主要机制是其本身含有nosZ基因，而利用植物根际促生菌减少土壤N₂O排放的的机制则是由于其改变了N₂O还原细菌群落的组成和丰度以及代谢活性。在$ {\text{NO}}_{\text{3}}^ - $和碳源的可利用性、O₂的浓度、水分含量、温度、pH和Cu²⁺浓度等环境因素中，pH和Cu²⁺浓度是影响N₂OR活性的两个最为关键的因素。微生物介导的土壤N₂O减排存在以下难点与问题：筛选获得的具有N₂O减排效应的菌株数量有限，接种微生物在自然环境中存活和定殖等情况不够明确，其功能发挥的微生物生态学机制不够清晰，有效调控影响其功能发挥的技术手段缺乏，以及评估其减排效果的方法尚有待改进等。

将来需要在以下几个方面开展相关研究。首先，进一步筛选获得高效的具有N₂O减排效应的N₂O减排微生物。从自然环境中筛选具有N₂O还原能力的新菌株或挖掘现有菌株的新功能，特别是筛选近些年发现的具有nosZ Ⅱ基因的非典型反硝化细菌；采用功能性宏基因组学、转录组和转座子测序等方法鉴定单个微生物在特定代谢位中其基因水平适应性的决定因素^[77-78]等将有助于推进农田N₂O减排技术的发展。其次，增强接种微生物在自然环境中存活和定殖等研究。例如通过创新方式克服在田间条件下接种微生物难以存活和定殖的困难，最大化提高接种微生物在农业土壤中的成活率；通过添加化学物质（如外源性物质）和载体（如有机肥、沼液、沼渣）为接种微生物创造适宜的生存环境；接种人工的微生物群落有可能增强接种微生物的生存能力和竞争能力；采用长时间内连续接种的缓释系统（如将其压缩至富营养基的开放式硅胶管）^[79]等。再次，进一步明确接种微生物功能发挥的微生物生态学机制。通过深入的遗传和生物化学研究确定微生物群落成员，接种人工微生物群落以发挥其复杂集合体的功能^[73]。然后，尝试调控影响其功能发挥的技术手段。如探究接种的N₂O还原细菌在特定代谢位中其nosZ基因表达水平的变化以及决定因素，结合测定结果通过添加特异的外源性物质精确地调节土著微生物群落，开展基于N₂O还原细菌的种属特异性调控。原位微生物组工程是通过工程化载体直接修饰自然微生物群落的宏基因组，可以更大范围和更高特异性地改变复杂微生物群落功能。原位微生物组工程或许可以为农业土壤N₂O减排提供关键技术^[73]。最后，改进评估N₂O减排效果的方法。建立合适的定量模型需要微生物生态学家、生物地球化学家、农学家、土壤学家和建模者进行紧密的跨学科合作。通过密切合作，将土壤微生物信息纳入相关模型，明确接种微生物在田间尺度或区域尺度对N₂O减排的贡献。总之，利用微生物减少农业土壤N₂O排放是一种低成本、高效益和切实可行的方法，可为我国实现农业碳中和战略目标提供重要技术参考。