2. 中国农业大学资源与环境学院, 北京 100193;
3. 潍坊科技学院贾思勰农学院, 山东寿光 262700
2. College of Resource and Environment, China Agricultural University, Beijing 100193, China;
3. Jia-Sixie College of Agriculture, Weifang University of Science and Technology, Shouguang, Shandong 262700, China
N2O是重要的温室气体,由于其极强的温室效应和臭氧层破坏潜势,以及长达120年的生命周期,一直是全球关注和研究的热点[1-2]。农业是重要的N2O排放源,农田土壤N2O排放量占人为排放源的66%,且主要发生在施肥和灌水后的脉冲式排放[3],而N2O脉冲式排放期间通常伴随着NO2-的大量积累[4]。Maharjan和Venterea[5]研究结果显示,NO2-解释了大约44%的全年N2O排放,Ma等[6]研究结果显示,由于添加的NH4+或尿素抑制了NO2-向
NO2-引起的N2O积累,一方面来自NO2-还原酶(NIR)与N2O还原酶(N2OR)对电子的竞争,电子竞争的加剧会导致NIR的电子通量高于N2OR的电子通量,造成N2O积累[7];另一方面则来自NO2-对N2OR活性的抑制[8-9]。此外,NO2-会通过诱导相关基因的表达改变N2O的排放途径,部分研究认为,出于解毒机制,NO2-会诱导含有nirK基因的氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)[10],利用氨氧化产生的电子还原NO2-,并最终以N2O作为终产物,发生硝化细菌的反硝化(nitrifier denitrification,ND)作用,该途径被认为是有氧条件下土壤氮素的主要损失途径[1-2,11];也有研究认为NO2-积累会促进土壤NO排放,高浓度的NO会通过激活转录因子(NNR)蛋白的活性而促进nirS基因的表达[12],进而发生异养反硝化(heterotrophic denitrification,HD)作用。但是,以上研究主要是基于水体或单菌株的研究成果,很少有研究从转录层面系统地分析土壤中NO2-积累与功能基因转录、N2O排放间的关系。
本研究选取两种典型蔬菜种植区土壤,模拟菜田土壤灌溉(厌氧培养)和正常持水条件下(有氧培养)出现NO2-积累后无机氮转化、气体排放(N2O、N2和CO2)和功能基因(amoA,nirK,nirS和nosZ)的丰度和转录情况,分析不同氧分压下菜田土壤中NO2-的转化规律、NO2-添加与功能基因转录、N2O和N2排放间的关系,以期揭示NO2-对设施菜田土壤N2O排放的影响机制,为识别土壤N2O排放途径、制定有效的N2O减排措施提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 采样地点及土壤样品采集本试验所用的土壤样品采自于华北平原东部两个定位试验。一份取自山东省寿光市中国农业大学蔬菜研究院示范基地日光温室长期定位试验点(简称VRS,36°85'N,118°87'E),温室建于2007年,试验设置4个处理,分别为传统漫灌+过度施肥(CFF)、传统漫灌+过度施肥+小麦秸秆(CFF+S)、滴灌+优化施肥(DIF)、滴灌+优化施肥+小麦秸秆(DIF+S),试验点的更多细节可参考Fan等[13]的研究。另一份供试土壤采集于山东省寿光市古城镇罗家村日光温室长期定位试验点(简称LJ,36°85'N,118°45'E),温室修建于1999年,试验设置了4个处理,分别为对照(CK)、有机肥处理(MN)、优化氮肥处理(RN)和传统氮素处理(CN),试验点的更多细节可参考Ren等[14]的研究。
本次试验选取的VRS和LJ两个长期定位试验点土壤样品均为农户习惯施肥处理,分别为CFF和CN处理,种植系统为一年两季番茄。VRS的施肥措施为在冬春季和秋冬季番茄移栽前,每季施用风干鸡粪8 t·hm–2(146 kg·hm–2氮)作为基肥,追肥时间根据作物的生长发育情况由农户决定,尿素作为追肥随灌溉水施用,化学氮肥平均投入量为每季895 kg·hm–2(以N计,下同)。LJ施肥措施与VRS相同,但其施肥量普遍高于VRS土壤,其中风干鸡粪投入量为每季10 t·hm–2(211 kg·hm–2氮),化学氮肥平均氮投入量为每季1 049 kg·hm–2。两个长期定位试验点土壤样品均在冬春季拉秧期(2014年07月)采样,采集土层为0~20 cm的耕层土壤,选15个采样点土壤混合为一个样品,土样过2 mm筛后风干备用。
两个长期试验点土壤的基础理化性质差异明显(表 1)。VRS土壤pH为8.02(碱性土壤),显著高于LJ土壤(pH为6.59,酸性土壤),但酸性土壤中有机碳、全氮、NH4+和
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表 1 表层土壤基础理化性质 Table 1 Soil physical and chemical properties |
前期研究结果显示,不同氮肥投入量下碱性土壤中NO2- -N的最高累积量为60 mg·kg–1左右,为了保证两种土壤外源底物投入量一致,培养开始时对碱性和酸性土壤同时添加60 mg·kg–1的NO2- -N作为底物。称取相当于10.0 g烘干土的预培养土样于120 mL血清瓶,设置四个处理,分别为:(1)厌氧不添加底物(N0(0%));(2)厌氧+ 60 mg·kg–1 NaNO2(N60(0%));(3)21% O2不添加底物(N0(21%));(4)21% O2 + 60 mg·kg–1 NaNO2(N60(21%))。模拟分析菜田土壤灌溉(厌氧培养)和田间正常持水条件下(有氧培养)施肥后出现NO2- -N积累时土壤氮素转化、气体排放和功能基因转录情况,下文中N0和N60分别代表不添加底物和添加60 mg·kg–1 NaNO2的处理。
具体的试验操作为:将灭菌水或含有亚硝酸盐的混合液依次用注射器均匀喷洒在血清瓶内的土壤中,并用灭菌水调节土壤的含水量为250 g·kg–1。所有血清瓶用铝盖密封后,根据试验设置利用抽真空-洗气系统(北京帅恩科技有限公司)直接用0%或21%的O2/He混合气体洗气3次后,充气3min并平衡血清瓶内气压,随后将所有血清瓶置于20℃恒温水浴槽中培养,利用Robot系统每间隔4 h测定一次培养瓶顶空气体(O2、N2O、N2、CO2)的动态变化,具体操作可见曹文超[4]的描述。根据气体监测结果,分别于0、16、84 h对相同培养条件下的静态培养试验进行破坏性采样,用于土壤RNA样品的提取,土壤DNA的提取频率与无机氮相同,仅在培养开始(0 h)和培养结束(84 h)时进行,总培养时间为84 h,每处理3个重复。
1.3 气体动态监测及土壤化学分析恒温培养槽内的样品连接Robot自动培养系统,实时在线监测O2、N2O、N2、CO2的动态变化。该系统由恒温培养系统、自动进样系统和气体分析模块三部分组成,实现了培养、采样、分析过程的全部自动化操作,系统的运行和采样详见Molstad等[15]。
土壤理化性质分析方法参考《土壤农化分析》[16]。破坏性采样完成后,立即称取10.0 g土壤样品于200 mL的聚乙烯瓶中,加入50 mL的氯化钾溶液(1 mol·L–1),20±2 ℃恒温振荡提取20 min后,转移大约40 mL提取液于50 mL聚乙烯离心管中,在3 000 r·min–1条件下离心分离5 min,取10 mL上清液–20℃保存,随后用连续流动分析仪(TRACCS2000,德国)测定
土壤细菌DNA使用试剂盒MP FastPrep1-24(MP Biomedicals,美国)进行提取,根据制造商要求进行操作。土壤RNA提取参考Ma等[17]的方法并根据提取土样的实际理化性质进行优化,粗提的RNA使用RNAse-Free DNAse试剂盒(Promega,美国)去除其中DNA后,取2 µL消化后产物以27f/907r为引物进行16S rRNA扩增,验证粗提RNA中DNA是否被消化完全;使用RNeasy® Mini试剂盒(Qiagen,德国)进行RNA纯化。使用NanoDrop分光光度计(ND 1000,Thermo Scientific,美国)测量试剂盒提取的DNA以及纯化后的RNA样本的纯度及浓度。纯化后的RNA样品采用随机引物以及Prime Script Reverse Transcriptase试剂盒(Promega,美国)进行反转录,DNA及合成的cDNA样品置于-20℃冰箱保存备用。
1.5 定量PCR使用Bio-Rad iQ5(Bio-Rad Laboratories,Mississauga,加拿大)对硝化(amoA)和反硝化(nirK、nirS和nosZ)功能基因丰度及其转录拷贝数进行定量PCR扩增。20 µL反应体系包括:10 mL的荧光定量PCR预混液(Promega,美国),引物各0.5 µmol·L–1,2 µL的cDNA模板或经过10倍稀释的DNA模板,用灭菌高纯水补足20 µL。定量PCR标线采用含有amoA、nirK、nirS和nosZ基因的克隆进行制备,首先进行目的基因扩增,扩增条件如表 2所示,将含有目的基因的克隆在Luria-Bertani培养液中过夜培养,提取质粒纯化并测定质粒浓度,根据摩尔常数计算目标基因的拷贝数,按照10倍浓度梯度进行稀释制作标准曲线(10–1~10–8)。每个96孔板中包含标准物质、样品和阴性对照,每个样品、标准物质和阴性对照3个重复,将得到的结果以标准质粒拷贝数的对数值为横坐标,以对应的循环阈值为纵坐标建立标准曲线,根据标准曲线计算样品基因丰度,循环结束后进行溶解曲线分析以检测PCR扩增的特异性。本研究中,扩增效率大于等于80%,溶解曲线为单峰且阴性对照无产物被认为是有效的PCR扩增。
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表 2 定量PCR的引物及扩增条件 Table 2 Primers and conditions used in the real-time qPCR analysis |
根据在线监测的血清瓶中气体数值和标气浓度,计算气体产生量和产生速率[22]。不同处理条件下N2O/(N2O+N2)指数(IN2O)计算公式如下[22]:
$ I{{\text{N}}_2}{\text{O}} = \int_0^T {{{\text{N}}_2}{\text{O}}(t)} dt/\int_0^T {\left[ {{{\text{N}}_2}{\text{O}}(t) + {N_2}(t)} \right]} dt $ | (1) |
式中,N2O(t)、N2(t)为培养时间t下的气体的累积产生量,T为培养时间。
数据利用SPSS 20.0进行相关性和显著性分析,采用SigmaPlot 12.5作图,文中涉及的
由表 3可见,培养结束时N0(0%)处理的碱性土壤和酸性土壤
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表 3 0%和21%氧分压下培养前后土壤无机氮含量 Table 3 Soil mineral N content before and after the incubation at 0% and 21% of O2 levels |
图 1为84 h的培养过程中土壤N2O、N2和CO2的动态变化。培养结束时碱性土壤N0(0%)和N60(0%)处理的N2O排放量分别为11.6和12.5 mg·kg–1,N2排放量分别为7.88和3.88 mg·kg–1;酸性土壤N0(0%)和N60(0%)处理的N2O排放量分别为9.15和11.8 mg·kg–1,N2排放量分别为13.2和0.78 mg·kg–1。厌氧条件下添加NO2-后碱性土壤和酸性土壤N2排放量分别减少了50.9% 和94.2%,NO2-的添加显著降低了两种土壤的N2O还原率(P < 0.01)。
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注:N0(0%)和N60(0%)分别表示厌氧培养条件下,不添加底物和添加60 mg·kg–1 NaNO2的处理;N0(21%)和N60(21%)分别表示好氧培养条件下,不添加底物和添加60 mg·kg–1 NaNO2的处理,下同。 Note:N0(0%)and N60(0%)represent the treatment without or with NO2- (60 mg·kg–1)addition under anaerobic culture conditions,respectively. N0(21%)and N60(21%)represent the treatments without or with NO2- (60 mg·kg–1)addition under aerobic culture conditions,respectively. The same as below. 图 1 0%和21%氧分压下两种土壤N2O、N2和CO2的动态变化 Fig. 1 Dynamics of N2O, N2 and CO2 production following the application of NO2- -N in alkaline soil and acid soil at 0% and 21% of O2 levels |
好氧条件下土壤N2O和N2排放量较低,N0处理时碱性土壤和酸性土壤N2O+N2排放量分别仅为厌氧培养的1.59%和1.97%,该条件下N60处理时两种土壤N2O和N2排放量同时增加,培养结束时碱性土壤N0(21%)和N60(21%)处理的N2O+N2排放量分别为0.31和0.46 mg·kg–1,酸性土壤N0(21%)和N60(21%)处理的N2O+N2排放量分别为0.44和2.02 mg·kg–1。
对于碱性土壤,N60(0%)处理CO2排放量与N0(0%)处理无显著差异,但N60(21%)处理CO2排放量显著高于N0(21%)处理。对于酸性土壤,N60(0%)和N60(21%)处理显著降低了土壤CO2排放量(P < 0.05)。
不同处理条件下两种土壤的N2O/(N2O+N2)指数(IN2O)见表 4。N0处理条件下酸性土壤IN2O低于碱性土壤,添加NO2-的处理则相反,N60处理显著增加了两种土壤的IN2O(P < 0.01)。
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表 4 不同处理条件下两种土壤的N2O/(N2O+N2)指数(IN2O) Table 4 The N2O/(N2O+N2)ratio following the application of NO2- -N in both soil at 0% and 21% of O2 levels |
如图 2所示,对于硝化功能基因,厌氧条件下两种土壤amoA转录拷贝数整体呈降低的趋势;有氧条件下,N60(21%)处理显著增加了碱性土壤转录峰值(16 h)时amoA的转录拷贝数(P < 0.01),但酸性土壤无此现象。
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注:不同的小写字母表示N0处理培养前后差异显著(P < 0.05),不同的大写字母表示N60的处理培养前后差异显著(P < 0.05),*_*和 |
对于反硝化功能基因,与N0(0%)相比,碱性土壤N60(0%)处理降低了16 h时nirS和nosZ的转录拷贝数,尤其是nirS,表现出极显著差异(P < 0.01),但显著增加了nirK基因的转录拷贝数(P < 0.05)。与N0(21%)相比,N60(21%)处理对碱性土壤反硝化功能基因的转录整体无显著影响,仅nirS基因在培养结束时转录拷贝数显著高于N0(21%)处理(P < 0.01)。酸性土壤中NO2-的添加对硝化和反硝化功能基因的转录表现出明显的抑制作用。
氧气显著降低了反硝化功能基因的转录拷贝数(图 2),与N0(0%)处理相比,转录峰值时(16 h)碱性土壤N0(21%)处理nirK、nirS和nosZ转录拷贝数分别降低了97.3%、74.5% 和89.0%。有氧条件下84 h的培养过程中,碱性土壤反硝化功能基因的转录拷贝数呈显著降低的趋势(P < 0.05);酸性土壤中不同反硝化功能基因的转录对氧气的响应不同,与N0(0%)处理相比,酸性土壤N0(21%)处理培养过程中仅nirK转录拷贝数显著降低(P < 0.05),nirS和nosZ转录拷贝数则分别表现出升高或先降低后升高的趋势。
2.4 培养前后土壤硝化、反硝化功能基因拷贝数的变化如图 3所示,碱性土壤中AOB的amoA基因拷贝数高出酸性土壤1~2个数量级。对于碱性土壤,除N0(21%)处理的amoA基因拷贝数培养结束时显著降低(P < 0.05)外,其余硝化、反硝化功能基因培养结束时拷贝数与培养初期无显著差异。
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图 3 0%和21%氧分压下培养前后硝化(amoA)和反硝化(nirS、nirK和nosZ)功能基因丰度 Fig. 3 The abundances of nitrification(amoA)and denitrification(nirS, nirK and nosZ)genes before and after the incubation at 0% and 21% of O2 levels |
对于酸性土壤,培养结束时不同处理条件下amoA基因拷贝数均无显著变化;N0(0%)处理培养结束时nir基因拷贝数显著增加(P < 0.05),N0(21%)处理培养结束时nir和nosZ均呈显著增加的趋势(P < 0.05)。添加NO2-的处理整体降低了酸性土壤反硝化微生物的增殖速度。
3 讨论 3.1 土壤中本次研究中两种土壤NO2-积累规律及对NO2-耐受性明显不同,碱性土壤中NO2-的自然积累量及对NO2-的耐受性更高(表 3和图 1),pH的差异可能是造成两种供试土壤NO2-积累规律明显不同的原因。土壤中NO2-的积累量随着pH的升高而升高,高pH环境下NO2- ,相对稳定,而低pH条件下土壤中NO2-与H+结合形成的HNO2可穿透细胞膜,导致其毒性随着pH降低显著增加[23]。同时,与Hu等[24]研究结果一致,文中碱性土壤amoA基因丰度及转录活性显著高于酸性土壤(P < 0.05),pH可能会通过改变土壤菌群结构影响土壤中氮素转化过程[25]。
3.2添加NO2-的处理显著增加了两种土壤的IN2O(表 4)。在N2O大量排放的厌氧条件下,N60处理时两种土壤N2O排放量增加、N2排放量显著降低(P < 0.01);好氧条件下N60处理时两种土壤N2O和N2排放量同时增加,且N2O排放量增加比例高于N2。
碱性土壤中,NO2-在厌氧培养条件下诱导土壤nirK转录,在好养条件下诱导土壤nirS转录,而对nosZ基因无明显诱导效应(图 2),推测在此类土壤中,NO2-主要是通过诱导nir转录促进NIR的合成,与N2OR竞争电子,降低N2O还原效率、增加土壤的IN2O[7,9]。酸性土壤中N0处理几乎未检测到NO2-的自然积累,但其N2O+N2排放量高于碱性土壤,表明土壤中NO2-相对含量并不一定与N2O或N2排放之间存在相关性。由图 2可见,酸性土壤N60(0%)的处理与N0(0%)处理相比nosZ转录拷贝数降低,但仍存在一定量的nosZ转录,然而与后者相比,前者N2排放量减少94.2%,土壤几乎未发生N2O还原,这与Liu等[26]研究结果一致,其认为在低pH土壤中,酶活性而不是基因转录活性降低,是导致低pH土壤中IN2O增加的主要原因。低pH会干扰细胞质中的翻译或细胞周质内蛋白的转运和合成过程[27-28],尽管N2OR不是组装和功能依赖于周质条件的唯一还原酶,然而,它可能是受低pH影响最严重的一种,反硝化的其他功能酶也位于细胞周质[28],这也解释了酸性土壤添加NO2-后基因转录与气体排放之间无明显对应关系的原因。此外,NO2-对N2OR活性的抑制也可能是引起N2O积累的重要因素[8-9],本次研究中外源NO2-的添加量为60 mg·kg–1(17.1 mmol·L–1),满足Baumann等[8]提出的NO2- (17和35 mmol·L–1)大量累积进而对反硝化产生抑制作用的浓度水平。
值得注意的是,好氧条件下观察到的N2排放量增加现象或许不能简单归结为N2OR活性的增加,受试验条件的限制,试验期间洗气、采样过程中不可避免地存在空气中N2入渗,导致N2测量值可能存在较大的误差,该现象在N2排放量极低的好氧条件下尤为明显。但是,N2O测量值是准确的,因此认为有氧条件下产物比计算结果仍有一定的参考价值。
3.3 土壤除厌氧处理外、HD可能同样是本次研究中碱性土壤好氧条件下N2O排放的重要途径。文中碱性土壤在N60(21%)处理时,外源NO2-诱导了nirS基因表达(图 2),且与Liu等[29]研究结果一致,与nirS基因相比,nirK基因转录对氧气更敏感。前人研究[12]认为,外源NO2-的添加为NO的产生创造了条件,而后者会通过激活转录因子NNR的活性而促进nirS基因的表达,进而发生了HD过程,结合碱性土壤在有氧条件下快速发生的NO2-氧化过程(表 3),推测NO2-氧化形成的厌氧“热点”为碱性土壤有氧条件下HD过程的发生创造了条件下。尽管试验过程中未观察到符合ND途径的、添加NO2-后amoA和nirK基因转录拷贝数同时增加的现象,但添加NO2-后有氧条件下amoA基因转录拷贝数显著增加(P < 0.01,图 2),这可能由于外源NO2-的添加诱导了含有nirK基因的AOB的amoA基因转录,然而由于本次研究中碱性土壤的
HD过程是酸性土壤中N2O排放的主要途径[1]。与碱性土壤不同,酸性土壤中NO2-的自然积累量、amoA转录活性整体较低,且其在N0(21%)处理时nirS基因转录拷贝数随着培养时间的延长而增加(P < 0.05),培养结束时nirS转录量高于nirK,推测nirS型反硝化菌是酸性土壤NO2-还原的主导菌,其也被认为是HD过程NO2-还原的主导菌[30]。相对较高的有机碳含量可能是酸性土壤有氧条件下nirS转录拷贝数增加的主要原因,Guo等[31]研究结果显示有机质与nirS-型反硝化菌而不是nirK-型反硝化菌的丰度显著正相关。真菌反硝化[1]、非生物途径的NO2-化学分解[23]等可能同样对酸性土壤的N2O或N2排放有一定贡献,但Chen等[32]发现,真菌在pH为4.0时较其他pH更丰富,Lim等[23]认为,在研究pH≤5的土壤中生物氮氧化还原转化时,需要考虑非生物亚硝酸盐动力学,而本次研究中酸性土壤的pH为6.59,因此真菌反硝化、非生物途径的NO2-化学分解对土壤N2O或N2的贡献量可能有限。
此外,本次研究中RNA和DNA层面功能基因拷贝数的变化情况也表明,仅从DNA水平出发研究功能基因丰度与N2O排放之间的关系有一定局限性[33]。大多数反硝化细菌为兼性好氧有机营养生物且偏好好氧生长条件,Nanang等[34]研究结果显示,反硝化功能基因(nirS、nirK和nosZ)丰度与土壤CO2累积排放量(表征易矿化碳)显著正相关。本次研究亦观察到CO2累积排放量偏高的酸性土壤中N0(21%)处理培养结束时反硝化功能基因拷贝数均显著增加(P < 0.05)、而CO2累计排放量较低的碱性土壤中无此现象(图 3)。因此,仅根据DNA层面功能基因拷贝数的变化情况显然不能有效解释本次研究中土壤N2O的排放机制,RNA和DNA层面的研究结果相结合可信度更高。
4 结论土壤中NO2-相对含量并不一定与氮氧化物排放之间存在相关性,但过多的NO2-积累会显著增加土壤的IN2O。除NO2-对N2OR活性的抑制外,在碱性土壤中,土壤微生物对NO2-的耐性较高,NO2-主要是通过诱导nir转录与N2OR竞争电子,降低N2O还原效率,增加土壤的IN2O;酸性土壤中微生物对NO2-的耐性较低,尽管外源NO2-添加后土壤中仍存在一定量的nosZ转录,但几乎不会发生N2O还原,此类土壤中H+通过干扰N2OR的合成等途径,增加土壤的IN2O。本次研究中HD过程是酸性土中N2O排放的主要途径,nir的转录情况显示碱性土壤中除厌氧处理外,HD可能同样是其好氧条件下N2O排放的重要途径。综上所述,在保证作物产量的前提下,精准施肥避免土壤中NO2-积累、降低NIR和N2OR对电子的竞争,适当提高土壤pH、降低其对N2OR酶合成的影响等,对降低菜田土壤N2O排放有重要意义。
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