生物质炭作为一种富碳产物，因具有良好的多级孔隙结构和功能特性，被用作土壤改良剂，不仅能够提高土壤肥力、修复土壤污染，还可以增加原位土壤固碳、减缓温室气体氧化亚氮（N₂O）排放，缓解气候变化^[1]。农田土壤作为N₂O排放的重要来源，已成为全球关注和研究的热点^[2]。我国作为粮食生产大国，截至2020年，粮食播种面积已达11.7亿公顷，其中水稻和小麦总播种面积占45.8%^[3]。稻麦轮作制度是我国东南部典型的种植制度之一，占我国粮食生产面积的8.2%，是我国温室气体排放的重要来源，其中稻田占全球N₂O排放的11%^[4-5]。研究表明生物质炭减少农田N₂O排放的主要机制有直接吸附、提高土壤pH、提高N₂O还原酶nosZ基因的表达及促进电子传递等^[6-9]。但大多数研究仅集中于生物质炭短期一次性大量施用^[10]，关于生物质炭长期效应的研究较少^[11]。

生物质炭施用到土壤后受周围环境影响逐渐老化，导致其物理性质（比表面积、孔隙度和孔径）和化学性质（pH和表面官能团）发生变化^[12]，进而影响土壤N₂O排放。研究发现温和老化生物质炭比表面积增大，微孔结构增多^[13]，会增加对N₂O的直接吸附。田间自然老化或利用化学条件老化产生的生物质炭pH会显著降低^[14]，则可能会削弱其对N₂O排放的抑制效果。Duan等^[15]大田试验观测到2年老化生物质炭仍具有显著降低黑钙土N₂O排放的能力，主要与生物质炭改善土壤曝气、提高土壤pH有关。Wu等田间试验研究^[5，16-17]也表明，3年和6年老化生物质炭均能够降低稻麦轮作体系温室气体排放，且3年老化生物质炭显著增加稻季土壤AOA（氨氧化古菌）和AOB（氨氧化细菌）丰度。但Spokas^[18]和Duan等^[19]室内培养试验研究发现，3年老化生物质炭丧失了最初对土壤N₂O排放的抑制能力，5年老化生物质炭则会促进酸、碱性土壤N₂O的排放。由此可见，不同试验条件下老化生物质炭对土壤N₂O排放的影响结果并不一致，作用机理也存在争议，需要在田间定位试验中探究其作用机理。

因此，本研究选择稻麦轮作系统开展田间定位试验，设置仅施氮肥、氮肥配施新鲜生物质炭、2年老化生物质炭和5年老化生物质炭处理，通过动态监测稻麦轮作周期内N₂O气体排放、测定土壤理化和氮循环相关功能基因丰度，综合评估生物质炭对N₂O缓解的长期效应及其微生物机制，以期为农业土壤施用生物质炭减排N₂O的措施提供科学的理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

田间定位试验于江苏省南京市江宁区秣陵镇（31°48′N，118°50′E）开展，试验区为典型稻-麦轮作系统，属亚热带季风气候区，年均温与年均降雨量分别为15.4℃和1 050 mm。试验观测期内日降雨和日均温如图 1所示。

试验地土壤类型为水稻土，质地为黏壤土，pH6.4、有机碳15.2 g·kg^–1、全氮1.4 g·kg^–1、全磷0.3 g·kg^–1、全钾13.2 g·kg^–1、容重1.2 g·cm^–3。试验供试生物质炭为400℃限氧条件下热解获得的小麦秸秆生物质炭，基本性质：pH 9.2、全碳462.4 g·kg^–1、全氮7.2 g·kg^–1、阳离子交换量（CEC）24.3 cmol·kg^–1、比表面积9 m²·g^–1、灰分21.4%。

1.2 试验设计与管理

田间定位试验采用随机区组设计，共设5个处理，每个处理3次重复，共15个小区，分别为CK（不施氮肥和生物质炭）、N（氮肥）、NB_0y（氮肥+新鲜生物质炭，2017年6月施入）、NB_2y（氮肥+2年老化生物质炭，2015年6月施入）和NB_5y（氮肥+5年老化生物质炭，2012年6月施入）。每个小区面积为20 m²（5 m × 4 m），各小区之间设有20 cm宽、40 cm深的水泥隔板和独立的灌水排水系统。

稻麦轮作田间管理措施与当地常规管理一致，水稻季和小麦季施肥分为基肥和追肥，其中尿素（以N计）250 kg·hm^–2，以4：3：3（基肥：追肥：追肥）的比例施入，钙镁磷肥（以P₂O₅计）60 kg·hm^–2和氯化钾（以K₂O计）120 kg·hm^–2均作为基肥一次性施入。具体施肥日期见Wu等^[5]研究。生物质炭分别于2012年、2015年和2017年6月水稻移栽前一次性翻耕施入40 t·hm^–2，后续不再施用。

1.3 气体样品采集与测定

试验观测期（2017年6月17日至2018年5月22日）采用静态暗箱法采集气体样品，同时测定采样箱内温度，施肥后和水稻烤田期每周观测4~5次，其余时间每周至少观测1次。采样箱规格为43 cm × 43 cm × 50 cm（作物生长前期）或43 cm × 43 cm × 110 cm（作物生长后期），采样时间（特殊情况除外）集中于上午8：00~11：00，于采样箱密封后0、10、20、30 min用20 mL针筒采集气体样品，返回实验室后立即用气相色谱仪（Agilent 7890A，Agilent Ltd，Shanghai，China）测定。按照吴震等^[17]提供的方法计算N₂O排放通量及其累积排放量。

1.4 土壤样品采集与测定

2017年10月水稻和2018年5月小麦收获后，各小区均按照五点取样法采集0~20 cm耕层土壤。采集的土壤样品一式两份：一份存放于4℃用于土壤理化分析；一份过2 mm筛，存放于–80℃用于土壤DNA提取。土壤pH按水：土比5：1浸提，Mettler-Toledo pH计（FE28，上海）测定。土壤充水孔隙度（WFPS）经烘干法测定土壤质量含水后转换而得，土壤铵态氮（$ {\text{NH}}_4^ + $-N）和硝态氮（$ {\text{NO}}_3^ - $-N）含量用2 mol·L^–1 KC1溶液浸提，紫外分光光度计（HITACHI，UV-2900，Japan）测定。土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾氧化法，全氮采用元素分析仪（Vario MAX，艾力蒙塔，德国）^[20]。

1.5 土壤DNA提取和qPCR定量分析

称取0.5 g土壤样品用Fast DNA SPIN Kit试剂盒（MP Biomedicals，Eschwege，Germany）提取DNA，采用SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒分别对土壤微生物功能基因amoA-AOA、amoA-AOB、nirS、nirK和nosZ进行定量分析。并将上述已知拷贝数的目的基因质粒DNA进行连续10倍梯度稀释后，在PCR扩增仪iCycler iQ5（Bio-Rad，美国）上进行荧光定量，得到标准曲线（三次平行）。各基因定量PCR分析引物和反应条件见表 1所示。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0（IBM Co，Armonk，NY，USA）对数据进行统计分析；采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Turkey比较法对各指标进行差异显著性分析（P < 0.05）；并利用Origin 2018（Origin Lab，USA）进行绘图。

2 结果 2.1 生物质炭对土壤理化性质的影响

如图 2所示，各处理对土壤理化性质的影响趋势稻麦两季基本一致。与CK处理相比，N处理显著提高稻麦两季土壤TN、$ {\text{NH}}_4^ + $-N、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量。生物质炭处理较N处理显著提高SOC含量35.6%~58.6%、TN含量8.4%~24.2%、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量13.3%~31.3%，降低$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量4.2%~13.9%，且TN、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量随着生物质炭老化年限的增加而增加，$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量则逐渐降低。

与N处理相比，生物质炭处理显著提高麦季土壤pH 0.53~1.17个单位，且均表现为NB_0y > NB_2y > NB_5y，并显著改善土壤充水孔隙度（WFPS）。生物质炭处理较N处理相比，显著提高土壤SOC含量21.4%~35.4%、TN含量9.7%~30.5%、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量1.7%~12.3%，降低$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量5.6%~25.3%，且TN、$ {\text{NO}}_3^ - $-N、$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量随生物质炭老化变化趋势与水稻季一致。综上所述，生物质炭老化后对土壤养分含量仍具有显著影响，但随着老化年限的增加其改善效果显著降低。

2.2 生物质炭对稻麦轮作系统N₂O排放的影响

由图 3可知，水稻季土壤N₂O排放通量仅在烤田期出现峰值，且变化范围为N 36.36~205.2 μg·m^–2·h^–1。小麦季则在基肥和第二次追肥后出现两次峰值，其变化范围分别为N 21.58~735.8 μg·m^–2·h^–1和23.61~343.4 μg·m^–2·h^–1。与N处理相比，生物质炭处理可降低稻麦整个周期内N₂O排放通量，且降低趋势为NB_0y > NB_2y > NB_5y。

土壤N₂O累积排放量表现为N处理最高，生物质炭处理随老化年限增加，N₂O累积排放量增加，且表现为麦季 > 稻季。与N处理相比，NB_0y、NB_2y和NB_5y处理均显著降低N₂O累积排放量，稻季分别显著降低54.0%、39.4%和35.5%，麦季分别显著降低44.6%、34.5%和32.4%。综上所述，老化生物质炭仍可在一定程度上降低土壤N₂O累积排放量，但随着老化年限增加其减排能力有降低趋势。

2.3 生物质炭对N₂O排放相关功能基因丰度的影响

由图 4可知，与CK相比，各处理均显著提高稻麦两季amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nosZ基因丰度，而nirS基因丰度仅在麦季显著增加。与N处理相比，NB_0y处理显著降低稻季amoA-AOB基因丰度31.9%，与amoA-AOA基因丰度无显著差异；相反，NB_5y处理显著提高amoA-AOA基因丰度39.1%，与amoA-AOB基因丰度无显著差异。生物质炭处理显著提高麦季amoA-AOA基因丰度79.2%~136.2%，而对amoA-AOB影响各异。与N处理相比，生物质炭处理对稻季AOA/AOB比值影响无显著差异，麦季则显著增加。

与N处理相比，生物质炭处理降低稻季nirS基因丰度6.0%~72.0%，增加nirK和nosZ基因丰度47.9%~110.5%和33.7%~249.4%，且nirK基因增幅表现为NB_5y > NB_2y > NB_0y，nosZ则相反。麦季生物质炭处理较N处理分别增加nirS、nirK和nosZ基因丰度–16.18%~80.58%、12.2%~138.1%和54.88%~206.7%，且nirK和nosZ基因丰度增长趋势与稻季一致。与N处理相比，生物质炭处理均能降低稻麦两季（nirS+nirK）/nosZ比值，但随着生物质炭老化年限的增加逐渐增加。

2.4 N₂O排放及相关功能基因与土壤理化性质的相关关系

由表 2可知，稻季N₂O累积排放量与土壤pH呈显著负相关（P < 0.05），与$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量、$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量、amoA-AOA及amoA-AOB基因丰度呈显著正相关。amoA-AOA与amoA-AOB基因丰度与SOC、TN、$ {\text{NO}}_3^ - $-N、$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量均呈显著正相关（P < 0.01）。土壤pH与nirS基因丰度呈极显著负相关，与nosZ基因丰度呈极显著正相关。nirK基因丰度与SOC、TN、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量均呈显著正相关。

由表 3可知，同稻季结果一致，麦季N₂O累积排放量与土壤pH值呈显著负相关，与$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量及amoA-AOB基因丰度呈显著正相关（P < 0.01）。amoA-AOA和amoA-AOB基因丰度均与TN、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量呈显著正相关，且仅amoA-AOB基因丰度与土壤pH值呈极显著负相关。nirK、nirS及nosZ基因丰度与SOC、TN、$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量均呈显著正相关。

3 讨论

本研究结果表明，稻季N₂O排放峰主要在烤田期，而麦季则主要在施肥后，且各处理麦季N₂O累积排放量均显著高于稻季，同Liu等^[4]和Wu等^[5]研究结果一致。由于稻田长期处于淹水状态，导致土壤通气性差，氧浓度低，反硝化作用进行完全，进而减少了N₂O的排放^[26-27]。

与N处理相比，无论是稻季还是麦季，生物质炭处理均显著降低N₂O排放，且减排效果表现为NB_0y > NB_2y > NB_5y（图 3），表明老化生物质炭对土壤N₂O排放的抑制作用降低。Liu等^[28]研究表明生物质炭对N₂O排放的影响受生物质炭施用年限的影响，与新鲜生物质炭相比，田间老化两年后减排N₂O能力显著降低。老化生物质炭自身表面特性变化也与N₂O排放密切相关。本研究发现不同时间老化生物质炭表面结构破坏严重，H和O含量增加，灰分含量降低（数据未发表）。Spokas^[18]室内分析指出田间老化生物质炭孔隙结构被堵塞、表面附着的硝化反硝化抑制剂被分解，可能导致其对N₂O的吸附和抑制能力下降。另有研究发现生物质炭在田间老化后，表面有明显覆盖层，可吸附大量细颗粒，增加硅、氧、铝等元素，降低碳含量，去除矿物覆盖层后与新鲜生物炭具有相似减排N₂O能力^[29]。老化生物质炭减排N₂O能力下降，还可能与土壤pH有关。土壤pH是调节土壤N₂O排放的重要因素，N₂O累积排放与土壤pH呈显著负相关（表 2、表 3）。与N处理相比，生物质炭处理增加土壤pH，但增幅随老化年限的增加而降低。研究指出，新鲜生物质炭表面有机酸在微生物作用下被分解，导致土壤pH增加^[30]，促进电子向反硝化微生物转移，有效降低N₂O的排放^[31]。随着生物质炭在田间自然老化，表面灰分降解，氧化和酸化作用使得生物质炭表面酸性含氧官能团羧基（-COOH）和羟基（-OH）等增加，导致土壤pH下降，可能会刺激N₂O排放^[29，32]。

土壤无机氮含量的变化可能导致老化生物质炭减排N₂O能力下降。稻麦季土壤N₂O累积排放均与土壤$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量呈显著正相关，仅稻季土壤N₂O累积排放还与土壤$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量呈正相关（表 2、表 3）。与N处理相比，土壤$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量随着生物质炭的老化逐渐下降，而$ {\text{NO}}_3^ - $-N则逐渐增加。Duan等^[19]对田间老化生物质炭进行剥离、室内重培养试验后发现，老化生物质炭能够增加土壤总氮矿化、氮固持及硝化速率，进而增加氮的生物有效性，并指出老化生物质炭能够显著增加土壤硝化和反硝化作用对N₂O的排放。本研究基于田间原位观测发现，N₂O排放可能与生物质炭的直接吸附作用导致$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量下降有关，且伴随生物质炭老化，表面酚基和羧基等酸性官能团增加，吸附作用加强，有利于减少硝化反应对N₂O的贡献^[33]。作为反硝化过程的底物和电子受体，老化生物质炭表面氢键化学吸附加强，增加$ {\text{NO}}_3^ - $-N在土壤中的保留，有效减少土壤$ {\text{NO}}_3^ - $-N的淋溶，又能促进反硝化作用N₂O的排放^[34]。老化生物质炭还通过影响硝化细菌反硝化过程降低N₂O排放^[35]。

生物质炭通过影响氮循环功能基因丰度影响土壤N₂O排放。与N处理相比，NB_0y处理显著降低amoA-AOB基因丰度，BN_2y和NB_5y则有不同程度的增加；生物质炭处理显著增加amoA-AOA丰度，增长趋势为NB_5y > NB_2y > NB_0y。已有研究表明，中碱性土壤中硝化作用主要由AOB而不是AOA主导^[36]。因此，新鲜生物质炭显著降低N₂O排放可能主要与amoA-AOB丰度降低有关。随着生物质炭老化，amoA-AOB丰度显著增加。徐刚等^[37]认为生物质炭主要是通过吸附作用降低抑制AOB活性的酚类化合物，促进硝化作用N₂O排放。Liu等^[38]则认为生物质炭能够促进铵（$ {\text{NH}}_4^ + $）转化为氨（NH₃），为氨单加氧酶（AOM）催化提供足够的底物，并能通过增加AOA和AOB丰度，促进硝化过程进行。

与N处理相比，随生物质炭老化，土壤nirK和nirS基因丰度逐渐增加（图 4）。通常认为nirK和nirS基因是反硝化过程中N₂O排放的主要贡献者。nirK基因与SOC呈显著正相关（表 2、3），已有研究表明富含有机分子的秸秆生物质炭会刺激nirK基因增加^[39]，且老化生物质炭会进一步提高nirK基因丰度^[19]。与N处理相比，生物质炭处理增加了稻麦季土壤nosZ基因丰度，且增幅表现为NB_0y > NB_2y > NB_5y。Sun等^[40]研究也发现生物质炭能够增加反硝化过程中nosZ基因丰度，从而降低N₂O排放。nosZ基因丰度与稻季土壤pH呈显著正相关（表 2）。Obia等^[8]指出生物质炭诱导土壤pH增加，会导致土壤中编码N₂O还原酶nosZ基因丰度增加，使反硝化产物N₂/N₂O的化学计量比增加，从而减少N₂O的排放。在田间自然条件下，老化生物质炭pH显著降低，对nosZ基因丰度影响减弱^[12]，导致其减排N₂O能力下降。（nirS+nirK）/nosZ作为N₂O排放重要的指示指标，随着生物质炭老化年限的增加，（nirS+nirK）/nosZ逐渐增加（图 4），表明老化生物质减排N₂O的能力下降。

4 结论

在稻-麦轮作周期内，新、老生物质炭均能显著改善土壤理化特性，降低土壤N₂O的排放；随着生物质炭老化年限的增加，土壤硝态氮含量及（nirS+nirK）/nosZ比值逐渐增加，从而导致生物质炭对土壤N₂O减排能力逐渐降低。本研究利用田间定位试验在2年和5年的时间尺度上分析了老化生物质炭对稻麦轮作体系土壤N₂O排放的作用机理，尚需从更长时间尺度探究自然老化生物质炭对N₂O排放的长期效应。