反硝化(Denitrification，Den)与硝态氮氨化(Dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA)是$ {\text{NO}}_3^ - $在厌氧状态下两条重要的还原路径。Den过程是指厌氧条件下$ {\text{NO}}_3^ - $转化为N₂O或N₂的过程^[1]，是农业土壤N₂O产生的主要途径。DNRA过程指厌氧条件下$ {\text{NO}}_3^ - $经硝酸盐还原酶转变为NO₂^-，再经亚硝酸还原酶最终转变为$ {\text{NH}}_4^ + $的过程^[2]，被认为有利于氮素在土壤中的保存与利用。目前通常采用¹⁵N同位素示踪法，通过培养实验，测定单位时间内N₂O或$ {\text{NH}}_4^ + $浓度的增量来计算土壤Den或DNRA速率/强度，反映其异化还原的潜力。研究发现，水稻土异化硝态氮还原过程中Den(76.75%~92.47%)为主要途径，DNRA(0.54%~17.63%)也有较大贡献^[3]，但无论Den或DNRA过程，其强度的变化受施肥措施的显著影响。研究表明，施用化肥反硝化酶活性增加，而固氮酶活性受到抑制^[4]，导致微生物氮循环失衡和稻田氮损失增加^[5]，土壤Den潜力显著增大^[6]。

沼液是沼气工程的副产物，富含氮素和作物生长所需的其他养分，施用于农田可以显著提高作物产量，因此已成为目前化学氮肥减量与替代的重要方式。尽管已有报道表明沼液施用可使农田土壤N₂O排放量增加^[7]，然而由于沼液同时含有$ {\text{HCO}}_3^ - $，小分子有机酸，各类矿质离子与营养物质，其对Den与DNRA的影响可能并不同于化学氮肥。秸秆还田作为是传统且重要的农耕措施之一^[8]，尤其是在当前“双碳”计划背景下受到了更多的关注。研究表明，秸秆还田不仅可以通过提供充足的碳源，还可以通过提高微生物活性^[9]对土壤氮素还原过程产生重要影响。然而，尽管目前在有关沼液施用或秸秆还田对反硝化过程的影响进行了一定的探索^[10]，但研究结果仍十分有限，并且可能由于受不同环境背景下土壤本身差异等因素^[11-12]的影响，导致对Den过程的认识还存在不少争议^[13-17]，并且尤其缺乏对DNRA过程的探索。因此，在当前化肥减量与替代需求下，进一步深入研究沼液替代化肥以及与秸秆联用对Den与DNRA过程的影响显得尤为重要。

我国江苏滨海地区地广人稀，土地成本低，分布着大量大型集约化畜禽养殖企业，大量沼液入田与利用已经得到当地农户的普遍认可，相关环境效应的研究也逐渐成为研究的热点。因此，本文选择该区域沼液消纳量最大的稻田为对象，通过田间定位试验，深入研究沼液替代化肥及其与秸秆联用对水稻不同生育期土壤Den、DNRA过程的影响，以期为沼液替代化学氮肥以及秸秆还田的环境效益评估提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 研究区概况

研究区位于江苏省东台市(32°38′23″N，120°53′59″E)，属于典型的季风气候，年均温度16 ℃，降水量为1 061 mm，年均日照达2 130 h。该区域农田为滨海盐碱地改良而成，土壤为粉砂质壤土，砂粒、粉粒、黏粒含量分别为36.2%、56.7%、7.1%。其中，稻麦轮种和秸秆全量还田为当地传统的耕作和农田管理模式。试验样地布设前，土壤pH为8.28，电导率(EC)为102 μS·cm^–1，土壤有机碳(SOC)、全氮(TN)、全磷、全钾含量分别为4.58、0.48、0.60和16.92 g·kg^–1。

1.2 试验设计

试验小区建于2016年，共设置对照(CK)、单施沼液(B)、单施化肥(C)、沼液秸秆联用(BS)和化肥秸秆联用(CS)5个处理。沼液和化肥的施用均依照当地农田肥料常规用量，总量为225 kg·hm^–2(以氮量计)，秸秆施入量为7.5 t·hm^–2，对照处理不施肥。每个处理3个重复，共15个小区(6 m×10 m)，各小区随机排布。为防止各小区间的干扰，使用防渗膜进行分隔。

供试沼液来自位于当地的中粮肉食(江苏)公司沼气站，沼液pH为7.94，TN、$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量分别为1.06、0.90 g·L^–1，总有机碳(TOC)含量为1.63 g·L^–1。作物种植实行稻麦两熟制度，水稻、小麦采用当地常用品种淮稻5号、扬麦16号。水稻和小麦生长季化肥(尿素，含氮量46.4%)与沼液的施用均按基肥、分蘖肥和穗肥2：1：2的比例进行分期施用。按照当地耕作习惯，水稻和小麦收获后的秸秆经粉碎后均进行直接还田(7.5 t·hm^–2)。种植方式及其他管理也同于当地。

于2020年分别在水稻分蘖肥施用前、穗肥施用前和水稻排水前采集土样样品。各小区随机取5点采集0~10 cm混合土样，每个样品3个重复。所采土壤样品去掉杂物后充分混匀，一部分土样保存于4℃冰箱用于土壤Den和DNRA潜力以及$ {\text{NH}}_4^ + $-N和$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量测定，其余土样风干过筛后进行土壤pH、EC、TN和SOC等含量的测定。

1.3 样品分析与测定 1.3.1 土壤Den和DNRA强度测定

取适量鲜土(干土量30 g)于250 mL塑料培养瓶中，向瓶中加入蒸馏水(使得加入标记液后水土比1：1)，加盖密封后置于振荡器上，调节振荡器转速为180 r·min^–1振荡15 min使得土样混合均匀。振荡处理后的土样中添加K¹⁵NO₃溶液(¹⁵N丰度为99.19%)，使土壤¹⁵N丰度(¹⁵N/(¹⁵N+¹⁴N))达到20%。添加完标记液后将土样与标记液充分混匀，加硅胶盖和封口膜密封，加入适量C₂H₂抑制剂(充分抑制土壤N₂O的还原)，25℃的温度条件下避光培养^[18]。分别在培养后的6 h和24 h将注射器针头插入培养瓶中反复抽压5次后各抽取两份20 mL瓶内气体待测。使用气相色谱仪(Agilent 7890A Series GC，美国安捷伦)测定其中一份20 mL气体样的N₂O浓度，另一份20 mL气体样，使用稳定性同位素质谱仪(DELTA V Advantage，美国热电)测定N₂O气体中的¹⁵N丰度。气体样品采集完成后，向塑料瓶中加入120 mL浓度为2 mol·L^–1的KCl溶液使得水土比达5：1，加盖后置于振荡器上以180 r·min^–1的转速振荡1 h。振荡完毕静置1 h后过滤，取10 mL滤液测定土壤浸提液中$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量，另取100 mL滤液采用孙建飞等^[19]的扩散法提取$ {\text{NH}}_4^ + $-N，并使用EA-IRMS联用技术测定提取的$ {\text{NH}}_4^ + $-N中¹⁵N丰度。

土壤Den和DNRA强度/速率的计算参照王新新等^[18]。分别以单位时间单位质量土壤N₂O-¹⁵N和$ {\text{NH}}_4^ + $-¹⁵N生成量表征土壤Den强度和DNRA强度，其单位为μg·kg^–1·h^–1。

1.3.2 土壤其他性状指标的测定

土壤pH采用雷磁pH计(pHS-3C)测定(水土比为2.5：1)；土壤EC(水土比5：1)采用电导率测定仪测定；TN采用凯氏定氮法测定；SOC采用TOC分析仪进行测定；$ {\text{NO}}_3^ - $-N和$ {\text{NH}}_4^ + $-N采用流动注射分光光度法测定。

1.4 统计方法

采用SPSS 23对数据进行统计分析，采用Origin 2018和Canoco 5绘图。采用单因素方差分析法比较特定生育期各处理土壤Den和DNRA潜力的差异显著性。不同的字母表示处理间的差异显著(P < 0.05)。采用冗余分析(RDA)分析土壤Den和DNRA潜力与土壤性状的关系。

2 结果 2.1 不同施肥处理土壤Den速率的变化特征

水稻分蘖期，B和C处理土壤Den速率均显著高于CK处理(P < 0.05)(图 1)，BS处理土壤Den速率为4.4 μg·kg^–1·h^–1，高于B处理1.3倍，而CS处理低于C处理89.4%。BS处理土壤Den速率高于CS处理16.8倍。抽穗期各处理间的差异与分蘖期较为相似，BS处理土壤Den速率与CS处理相比也显著增加，增长幅度为53.6%。水稻成熟期，各处理土壤Den速率均高于CK(P < 0.05)。其中，BS处理土壤Den速率高于CS处理(31.2%)，二者均高于C处理(5.6 μg·kg^–1·h^–1)和B处理(3.8 μg·kg^–1·h^–1)。就水稻整个生育期而言，土壤N₂O总生成量表现为B处理(15.3 mg·kg^–1)最低，BS处理(34.6 mg·kg^–1)最高，B、C、BS和CS处理土壤均在成熟期N₂O总生成量最高(表 1)。

2.2 不同施肥处理土壤DNRA速率变化特征

水稻分蘖期，B和C处理土壤DNRA速率分别为2.8 μg·kg^–1·h^–1和1.4 μg·kg^–1·h^–1(图 2)，分别高于对照CK处理4.7倍和1.9倍，且B处理显著高于C处理(94.7%)；BS处理显著高于CS处理(36.7%)，且二者分别高于B和C处理90.8%和1.7倍。水稻抽穗期，B和C处理土壤DNRA速率无显著差异，BS和CS处理分别显著高于B和C处理68.7%和1.3倍，且BS处理高于CS处理31.4%。水稻成熟期，BS、CS和C处理土壤DNRA速率均显著高于CK处理，但三者间无显著差异，B处理则与CK间无显著差异。

2.3 土壤DNRA和Den的相对重要性

以DNRA速率与Den速率的比值表征土壤DNRA和Den的相对重要性大小(DNRA/Den)，该比值大于1则表示DNRA过程占主导，且该比值越大表示DNRA和Den速率相差越大^[20]。水稻分蘖期，B处理土壤DNRA/Den为1.5，显著高于C处理(0.6)(图 3)。BS处理土壤DNRA/Den(1.2)显著低于CS处理(15.7)。水稻抽穗期和成熟期，土壤DNRA/Den均以CK处理最高，其他4个处理间无显著性差异。

2.4 水稻不同生育期土壤性状的变化

土壤pH的变化表现为水稻分蘖期CK显著低于其他各处理(图 4a)，抽穗期，BS处理土壤pH显著高于其他处理(P < 0.05)。不同生育期下，B处理土壤EC值均显著高于CK处理(图 4b)，CS与C处理间无显著差异；BS处理土壤EC值在抽穗期和成熟期均高于CS处理。各生育期土壤SOC和TN含量的变化总体表现为CK低于其他4个处理(图 4c，4d)，其中土壤TN含量均表现为BS处理显著高于CS处理。土壤$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量的变化为分蘖期和成熟期均以C处理显著高于其他处理，而抽穗期则以B处理最高(图 4e)。土壤$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量为在水稻分蘖和成熟期，BS处理显著高于B处理和CS处理，在抽穗期则相反(图 4f)。

2.5 土壤Den和DNRA速率及其相对重要性与土壤性状的关系

采用RDA分别对各处理土壤Den、DNRA速率及其相对重要性与土壤性状的关系进行分析(图 5)，可见B和C处理土壤Den速率均与pH表现出正相关性，而与C：N为负相关。B处理下，土壤Den速率还与$ {\text{NO}}_3^ - $-N和$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量分别表现正相关和负相关性；土壤DNRA速率与TN和SOC含量为负相关(图 5b)。C处理下，土壤Den速率与EC呈负相关；土壤DNRA速率与$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量表现出正相关，而与SOC含量为负相关(图 5c)。BS和CS处理土壤Den速率均与$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量正相关，与$ {\text{NH}}_4^ + $-N含量为负相关。此外，BS处理土壤Den速率与pH、土壤DNRA速率与C：N也均为出正相关(图 5d)。CS处理土壤DNRA速率则与pH表现出正相关而与TN含量负相关(图 5e)。

3 讨论 3.1 稻田土壤Den变化特征及影响因素

化肥或沼液的施用可对土壤Den速率有显著影响。本研究结果表明，水稻3个不同生育期下，4个施肥处理土壤Den潜力总体上均表现为高于CK处理(除分蘖期CS低于CK外)，其中，BS处理也显著高于CS处理，这表明化肥或沼液的单独施用以及与秸秆的联用均会导致土壤Den潜力的显著升高。这可能主要与氮素的大量的输入有关，尤其是沼液中含有更多的有效态氮，沼液秸秆联用措施下土壤微生物的丰富度和多样性均会提高^[21]。就秸秆还田而言，目前就该措施对土壤Den潜力的影响的认识存在较大差异。一方面，有研究认为秸秆还田可通过提供充足的碳源和提高Den微生物活性等途径提高土壤Den强度^[9]。如施加复合肥的沙壤水稻土结合水稻秸秆还田措施后，土壤Den功能基因的丰度显著提高，Den速率显著增加^[13]。化肥秸秆联用措施下，粉质黏壤土Den功能基因的丰度显著增大，Den速率表现为显著高于只施加化肥处理^[15]。Shaaban等^[14]也发现水稻土添加水稻秸秆后，土壤微生物量碳和可溶性有机碳含量显著提高，Den速率显著增大。另一方面，也有研究显示，秸秆还田可导致土壤Den速率减小或无显著变化^[22-23]，其原因主要在于秸秆还田下土壤有机质增多，可通过促进厌氧微生物对$ {\text{NO}}_3^ - $-N的固定^[24]，以及有机质分解过程对O₂消耗的途径抑制硝化作用，减少土壤$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量进而使得稻田土壤N₂O的释放量减少^[25]。

土壤Den速率的变化同时受作物生育期的影响。从不同生育期来看，本研究中B、C和BS处理土壤Den速率均是分蘖期大于抽穗期，这与吴讷等^[26]的研究结果一致，但各处理间的差异又有所不同。B处理土壤Den速率在成熟期显著低于C处理，但在分蘖期和抽穗期二者无显著差异。秸秆还田措施下，BS处理土壤Den速率在各同生育期均高于CS处理，这可能是沼液秸秆联合施用下形成了更利于Den进行的环境条件。值得关注的是，分蘖期化肥秸秆联用土壤Den速率低于化肥处理，这可能与该时期秸秆对化肥中氮素的强化固定导致Den过程所需的$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量减少^[27]有关，从而使得土壤Den速率降低。

相关性分析显示土壤理化性质对Den潜力有较大影响。其中，B、C处理土壤Den潜力均与pH、C：N高度相关，但沼液处理(即B处理)Den潜力与pH的关系更为密切(P < 0.01)。这可能与沼液添加改变了土壤pH有关。尽管pH的变化在B、C处理间无显著差异，但已有文献报道施加沼液可有效降低土壤pH，例如Zhang等^[28]研究表明施用沼液5年后，土壤pH显著降低，这主要是由于沼液中含有大量$ {\text{NH}}_4^ + $-N，$ {\text{NH}}_4^ + $的氧化将大量H⁺释放到土壤中，使土壤pH降低。Tang等^[29]研究也证实，水稻收获后，不同用量的沼液处理土壤pH均低于种植前。沼液处理导致水稻土壤pH降低，这对土壤溶液中多酚类化合物和有机酸的释放有积极影响，可能改变了土壤微生物的环境条件，使某些有益菌群富集^[30]。由于Den更适合土壤6.5~7.5的pH环境^[31]，沼液对pH的降低应当加速N₂O的释放，但本研究显示，沼液替代化肥即B处理较化肥C处理的Den速率降低了1.48 μg·kg^–1·h^–1，N₂O的总生成量减少了27%。相较而言，配施秸秆后(BS、CS)$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量与Den潜力相关度最高。这可能主要是由于秸秆分解释放有机碳，不但较沼液或化肥单施提高了土壤pH^[32]，而且提供了大量电子供体，最终使$ {\text{NO}}_3^ - $-N成为Den的限制因子^[33-34]。然而，秸秆与沼液配施导致N₂O释放激增的原因可能还与土壤C：N的变化有关。土壤C：N的升高可促进对氮素的净固定并降低N₂O产生，反之会促进N₂O的产生^[12]。本研究BS处理(分蘖期和成熟期)的土壤$ {\text{NO}}_3^ - $-N含量均高于B和CS处理，而C：N均低于B和CS处理，因此可能导致出现其Den速率和N₂O产生量均较高的结果。

3.2 稻田土壤DNRA变化特征及影响因素

不同施肥措施对土壤DNRA过程的影响具有显著差异。研究表明长期施氮会对固氮酶活性产生抑制作用^[35]，因此导致土壤DNRA速率随着氮肥施用量的增加而减小^[5]。秸秆还田措施往往有利于土壤DNRA潜力的提高，如水稻秸秆还田后紫砂岩土和红砂岩土DNRA潜力均显著增加^[17]。Zhang等^[16]也表明水稻土添加秸秆后土壤DNRA潜力随秸秆添加量的增加而增大。本研究结果显示，B处理土壤DNRA潜力显著高于CK处理，这是因为沼液中大量有机质向土壤中输入，为微生物提供养料，有益于土壤氨化细菌的生长繁殖^[36]。5个处理中均以BS处理的土壤DNRA速率为最高，分别较B处理和CS处理高40.7%~59.3%和16.5%~26.8%，这表明秸秆还田和沼液替代化肥均可促进土壤DNRA潜力的提高，有利于更多氮素的保存，并且沼液秸秆联用的效果最好。这一方面可能是由于沼液施用显著提高了土壤中养分含量以及土壤中三大类菌和氮循环细菌的数量^[36]，从而使土壤DNRA潜力增大，另一方面也可能由于秸秆中C：N较大，微生物需要从土壤中吸收更多无机氮以满足分解秸秆过程中的氮需求^[17]，因此，随着秸秆掺入率的增加，$ {\text{NH}}_4^ + $固定化速度加快，并且由于$ {\text{NH}}_4^ + $同化和固定化，硝化作用会受到限制^[37]。

本研究也表明，各处理间土壤DNRA潜力的差异同时受水稻生育期的影响。分蘖期各处理土壤的DNRA速率均显著高于成熟期和抽穗期，如沼液处理(B、BS)分蘖期分别是抽穗期的3.9倍和4.5倍，是成熟期的4.0倍和3.1倍；化肥处理(C、CS)分别是抽穗期的3.7倍和4.3倍以及成熟期的1.0倍和2.7倍，并且B和BS处理DNRA潜力显著高于C和CS处理。这可能是因为分蘖期正处于秸秆的分解前期，秸秆中的高碳支持更活跃的微生物种群，增加了土壤微生物生物量而有助于DNRA过程^[38]。

土壤理化性质的变化也是影响DNRA潜力的关键因素，但不同土壤性质对各处理DNRA潜力变化的影响程度不同。陈瑶等^[39]发现沼液施用后土壤有机质含量增加，是沼液施用下土壤SOC含量显著增大的重要原因。本研究中，B处理下土壤DNRA与TN和SOC含量呈负相关；C处理下土壤DNRA与$ {\text{NO}}_3^ - $-N呈正相关，与SOC呈负相关，这可能与不同施肥措施下土壤性质变化导致微生物量以及微生物群落改变有关。CS处理下，TN、pH与DNRA相关度最高，但BS处理时，C：N成为最主要的影响因子。该变化的原因可能在于沼液为秸秆分解提供了比化肥更适宜的环境，C、N等物质的释放稀释了TN、pH的影响，最终形成C：N限制DNRA过程的状态。

DNRA/Den值表征土壤DNRA和Den相对重要性高低，该值大于1则表示硝态氮还原过程中DNRA过程可能占主导；反之，则Den占主导地位。由于Den与DNRA属于$ {\text{NO}}_3^ - $还原的不同途径，这意味着二者存在“此消彼长”的关系。在抽穗期和成熟期，沼液B处理和化肥C处理均以Den为主，而在分蘖期，B、BS、CS处理DNRA过程占优。这表明，水稻生育期，无论是否沼液替代化肥或是否秸秆还田，Den是$ {\text{NO}}_3^ - $还原的主要方式这与以往研究相似^[3]。但应当指出的是，沼液替代化肥通过DNRA过程时氮素的保存对N₂O的控制仍具有积极意义，尤其是，沼液替代化肥具有减少N₂O产生和排放的潜力。因此，基于N₂O的控制及水稻产量提高双赢的目标，沼液替代化肥值得推广。但由于沼液替代化肥的推广还需要有养分利用效率、土壤肥力、温室气体及氮损失等监测基础和综合环境经济效益等方面的科学评估作为支撑，其具体的应用推广模式以及是否同步秸秆还田等还需要进一步研究。

4 结论

沼液替代化肥以及与秸秆联用，对稻田土壤Den和DNRA过程均有显著影响，并与水稻生育期密切相关。整个生育期不同处理的土壤反硝化(Den)强度依次为：BS(34.6 mg·kg^–1) > C(20.9 mg·kg^–1) > CS(20.4 mg·kg^–1) > B(15.3 mg·kg^–1) > CK(2.9 mg·kg^–1)。沼液替代化肥可有效降低稻田反硝化强度和N₂O生成，但沼液与秸秆配施导致反硝化强度显著增加。从不同生育期看来，沼液处理(B、BS)与化肥处理(C、CS)均在成熟期出现最高的反硝化强度，因此在成熟期对N₂O进行调控显得尤为必要。此外，无论是否秸秆还田，水稻分蘖期各处理土壤DNRA潜力均最高，并且沼液替代化肥处理土壤DNRA潜力增大，有利于土壤氮素的保存。