2023, Vol. 60
2. 海南省农业科学院农业环境与土壤研究所/农业农村部海南耕地保育科学观测实验站/海南省耕地保育重点实验室, 海口 571100;
3. 中国科学院高能物理研究所软X射线实验站, 北京 100049
2. Institute of Agricultural Environment and Soil, Hainan Academy of Agricultural Sciences/Hainan Scientific Observation Station of Cultivated Land Conservation of Ministry of Agriculture and Rural Areas/Key Laboratory of Cultivated Land Conservation in Hainan Province, Haikou 571100, China;
3. Soft X-ray Experimental Station, Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
将农业和城市有机废弃物加工为有机肥料是处理这些废物的一种具有成本效益和生态友好的方式[1]。已有研究表明有机（类）肥料的施用显著改变了土壤物理化学性质，如显著增加土壤总孔隙度，促进土壤中大团聚体颗粒的形成；还有改善土壤综合肥力、增加土壤碳固存[2-3]和修复土壤污染问题等功能[4]。我国有机肥料的年产量达到1.63×107 t，占整个肥料产业的30%以上[5]。因此，有机肥已在我国农业生产中发挥着重要作用。
土壤溶解性有机质（dissolved organic matter，DOM）是指土壤中能够溶于水、酸、碱、盐溶液等，并能通过一定孔径滤膜（如0.45 μm），含碳、氮、磷等元素且具有不同结构及分子量大小的有机物的连续体[6-7]。DOM作为土壤有机质最活跃的组成部分，在土壤养分有效性、温室气体排放以及污染物迁移等方面起着极为重要的作用[8-9]。施入土壤的有机肥料在分解过程中也深刻影响土壤DOM的含量与组成[10-11]。早期已有研究表明，施用有机肥能使土壤DOM的含量迅速升高，而后慢慢降低[12]，而且可通过增加土壤DOM中复杂芳香化合物的含量，从而显著提高DOM的芳香性[13-14]。此外，生物质炭添加至土壤中可提高土壤pH，使DOM溶解度增加，导致DOM吸附物释放至土壤中，从而增加土壤中活性碳通量和DOM的生物利用度。这一过程最终会影响污染物的归趋、养分的可利用性以及全球温室气体排放的调节[15]。但鲜有研究从分子层面解析不同来源有机肥分解对土壤DOM分子特征的影响。
各种光谱技术已被应用于确定DOM的组成和结构，如傅里叶变换红外光谱（FTIR）[16]、激发射激发矩阵（EEM）结合平行因子分析（PARAFAC）[4，17]。但由于来自有机肥料的DOM官能团具有高度的异质性和不均匀性，上述光谱方法的可用性也受到限制。近年来，二维相关光谱（2DCOS）可通过沿二维扩展光谱来解析重叠峰，从而深入了解DOM中分子结构的变化。2DCOS与FTIR结合可提供响应外部扰动的结构变化的相对方向和顺序信息[18]。此外，碳近边X射线吸收精细结构光谱（C 1s NEXAFS）在表征有机碳的官能团结构与组成方面具有巨大的优势和潜力[19]。因此，结合EEM- PARAFAC、2D-FTIR-COS和C 1s NEXAFS的方法有望深入了解施肥引起的土壤DOM分子变化，并有助于解决有机肥分解过程中土壤DOM响应的分子机制，为扩展对商业有机肥料应用潜力的理解提供理论指导。
海南昌江县昌化矿区于1991年闭矿后对矿区周边生态环境造成严重破坏，2006年针对昌化矿区的生态环境修复治理后，周边农田土壤质量得到良好恢复，但土壤有机质等肥力特征依然较低且有轻度的污染。有机肥料的施用可促进土壤中大团聚体颗粒的形成，提升土壤肥力和环境质量[20]。因此，本研究以昌化矿区周边的土壤为对象，通过室内培养试验，并采用多元光谱分析研究不同来源有机肥不同分解时期土壤DOM的含量、分子组成变化，从分子水平解析土壤DOM分子特征对不同来源有机肥分解的响应，为进一步理解施入有机肥对土壤碳固存的影响以及修复土壤污染物等问题提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 有机肥样品的采集及基本理化性质的测定在前期对海南省有机肥市场全面取样调查[21]的基础上，选择具有代表性的四种不同来源商品有机肥。样品经风干、磨细，过1 mm筛，装入自封袋置于阴凉干燥处保存备用。供试有机肥的基本理化性质测试参照有机肥国标NY525-2012[22]，四种有机肥的具体来源及基本理化性质如表 1。
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表 1 四种商品有机肥的基本理化性质 Table 1 Basic properties of tested organic fertilizers |
采集成土母质为花岗岩的海南省昌江县昌化矿区周边（19°19′38″N，108°42′0″E）的表层土壤（0~20 cm）。采用“S”采样法采集土壤样品，混合均匀后去除大颗粒杂物后自然风干，过2 mm筛备用。
供试土壤基本理化性质采用《土壤农化分析》[23]测试。供试土壤的基本理化性质为：有机质18.01 g·kg–1，全氮0.17 g·kg–1，全磷0.22 g·kg–1，全钾8.43 g·kg–1，pH 6.18，阳离子交换量（CEC）7.77 cmol·kg–1，土壤质地为砂质壤土。
1.3 土壤培养试验土壤培养试验共设5种处理，分别为1）空白对照（不施有机肥），记为CK；2）添加50 g·kg–1的羊粪有机肥，记为SM；3）添加50 g·kg–1的海藻有机肥，记为SW；4）添加50 g·kg–1的虾肽有机肥，记为SP；5）添加50 g·kg–1的生物质炭肥，记为WSB；每个处理重复三次。有机肥与土壤充分混合均匀，并调节含水量保持在田间持水量的70%，在（25±5）℃条件下培养。于培养的第0、5、15、45、90天取样，除去根系与砾石，部分直接提取DOM溶液，部分在室温下风干后研磨过2 mm尼龙筛，储存在黑暗干燥通风处备用。
1.4 土壤DOM溶液的提取及表征土壤DOM溶液的提取参照訾园园等[24]的方法，称取30 g土壤于离心管中，加入超纯水150 mL（w/v，1：5）混合。所有样品于25℃的恒温振荡箱（180 r·min–1）避光振荡24 h，然后以4 000 r·min–1离心20 min。上清液使用超滤装置在避光条件下过0.45 μm滤膜。然后将滤液避光储存于4℃的冰箱以进一步分析。有机肥料中DOM的浓度通常表示为溶解性有机碳（DOC），使用TOC分析仪（TOC-V CPH，日本岛津）测定。
1.5 DOM光谱的表征在进行三维荧光光谱测定之前，将各培养期间提取DOM滤液中的DOC浓度调整为10 mg·L–1，以避免内部过滤效应并确保可比性。用配备150 W氙弧灯激发源的荧光分光光度计（F-320，天津港东科技）扫描样品，激发波长Ex=200~450 nm，发射波长Em=230~650 nm（Ex和Em的增量均设为5 nm），狭缝宽度为10 nm，扫描间隔为1 nm。
红外光谱采用原DOM滤液测定，将DOM滤液冷冻干燥，取冻干的DOM样品（1.0 mg）与200 mg的KBr混合并研磨均匀，压成薄片。使用傅里叶变换红外光谱仪（Spectrum 65，珀金埃尔默公司，美国）扫描，扫描波数范围4000~450 cm–1。
1.6 碳近边X射线吸收精细结构（C 1s NEXAFS）分析取不同施肥处理培养第90天过2 mm筛的土壤样品经冷冻干燥后，用铜胶带固定在样品架上于北京同步福射装置（BSRF）的4B7B光束线站收集碳近边X射线吸收精细结构（C 1s NEXAFS）光谱，以分析土壤样品中碳组分的相关信息。该线站储存环的电子能量为2.5 GeV，流强为156~250 m，采用全电子产额（total electron yield，TEY）的测定模式收集谱线（设置能量范围280~310 eV；能量分辨率0.05~0.5 eV；X射线光斑大小为1 mm2），测试样品前需在10–6 Pa的真空环境下保持12 h，并在样品扫描之前使用相同的铜带获得背景光谱。
1.7 最优化分析本研究基于MATLAB 2014b中的DOM Fluor工具箱，采用平行因子分析（PARAFAC）对DOM样本的EEM光谱进行分析。在平行因子分析（PARAFAC）建模之前，根据Bahran等[25]的方案确定最终的正确荧光组分数。
将FTIR光谱与2DCOS分析相结合，从而获得DOM的组成和结构变化顺序信息。基于“2D shige”软件的2DCOS（关西学院大学，日本）分析。
1.8 数据统计分析应用SPSS 20.0进行数据分析，图表中数据均为3次重复的平均值。采用单因素方差分析显著性（P < 0.05）。NEXAFS的所有数据均使用ATHENA（0.8.056版）进行归一化处理，再用Origin 9.0进行分峰拟合，最后绘制成图片。
2 结果 2.1 施用不同来源有机肥后土壤DOM含量的动态变化施用不同来源有机肥后，土壤DOM含量随有机肥降解时期的变化如图 1所示。施用有机肥能显著增加土壤DOM的含量，其中施用海藻（SW）、虾肽（SP）、羊粪（SM）有机肥的土壤DOM含量显著高于对照（CK）和施用生物质炭（WSB）的。五种处理下土壤DOM含量随培养时期变化显著，其中CK和WSB处理的DOM含量呈波动下降，而SW、SM和SP处理的DOM含量则整体呈先上升后下降趋势。SW和SP处理的土壤DOM含量在第15天出现峰值，而SM则在第45天时出现峰值。在培养结束（第90天）时，所有处理的DOM含量均小于培养开始时期（第0天）。
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注：CK，对照；WSB，生物质炭肥；SW，海藻有机肥；SM，羊粪有机肥；SP，虾肽有机肥；不同小写字母表示同一处理下不同时期间的差异显著（P < 0.05）；不同大写字母表示同一时期下不同处理间的差异显著（P < 0.05）。下同。 Note: CK, control; WSB, wheat straw derived biochar; SW, seaweed; SM, sheep manure; SP, shrimp peptide; Different lowercase letters indicate significant differences between different times(P < 0.05);Different capital letters indicate significant differences between different fertilizer treatments(P < 0.05). The same below. 图 1 各施肥处理下不同降解时期土壤溶解性有机碳（DOC）含量 Fig. 1 Soil dissolved organic carbon(DOC)content in different degradation periods under different fertilization treatments |
结合Matlab平行因子分析，5种处理下土壤DOM均识别出类似的3种组分：C1（Ex/Em = 330/416）：类胡敏酸荧光组分或是半醌类成分，或是与微生物转化有关的组分[26]，或是微生物再加工释放的颗粒态有机物[27]；C2（Ex/Em =380/474）：类胡敏酸荧光组分或是氧化醌类物质[28]，或是难降解成分[26]；C3（Ex/Em =277/488）：类富里酸荧光组分或是还原半醌类成分，或是高分子量物质[29]。
三种荧光组分的百分占比随着分解时期的变化如图 2所示。所有处理下的土壤DOM荧光组分随分解时间发生了明显的变化。除WSB处理外，其他四种处理均以C1组分占比最高，达40%以上，其次是C3组分（30%~40%），C2组分占比最低（10%~20%），并且C1和C2组分随分解时期波动下降，而C3组分略有升高，其中以对照（CK）变化最为明显。而在WSB处理中，仍以C1组分占比最高，达50%以上，其次是C2组分，C3组分占比最低，其中C1和C2组分随分解时期增加而波动升高，而C3组分则波动下降，在第15天C3组分占比最低，为1%。培养结束后，四种有机肥处理与CK相比均增加了C2组分，其中WSB处理增加最明显，增加了25%；而减少了C3组分，WSB处理减少最明显，减少了44%；而对于C1组分，除WSB处理表现出显著增加外，SW、SM和SP处理变化均不明显。
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注：C1，微生物转化的类胡敏酸荧光组分；C2，难降解的类胡敏酸荧光组分；C3，类富里酸荧光组分。 Note: C1, fluorescent fraction of microbially transformed humic acid-like fractions; C2, difficult to degrade fluorescent fraction of humic acid-like; C3, fulvic acid-like fluorescent components. 图 2 各施肥处理下不同降解时期土壤DOM荧光组分占比 Fig. 2 Percentage of soil DOM fluorescence components in different degradation periods under different fertilization treatments |
五种处理下土壤DOM的傅里叶变换红外光谱中各吸收峰位及其归属如表 2所示，所列峰在所用样品中均有出现。基于红外光谱结合二维相关分析（2D-COS）可更详细地表征五种处理下土壤DOM的官能团随分解时期发生的细微变化。各施肥处理下土壤DOM随培养时间变化的二维红外光谱（1 800~650 cm–1）如图 3所示。CK的同步光谱图分别在1 200 cm–1（羧基的C-O拉伸和O-H变形）、694 cm–1（烯烃CH2-伸缩振动）处出现2个主要自动峰，异步光谱图同时存在正交叉峰和负交叉峰，分别出现在1 070/694 cm–1、1 280/694 cm–1、1 280/ 1 070 cm–1、1 442/1 280 cm–1、1 442/1 070 cm–1、1 442/694 cm–1处，表明了随着培养时期进行，土壤DOM的各种官能团如多糖、烯烃、羧基、芳香族和羟基等均发生了变化。根据Noda定律，CK处理土壤DOM的官能团随培养时间变化的先后顺序依次为：1 280 cm–1（羧基C-O拉伸和O-H变形）、1 442 cm–1（芳香族N=O拉伸）、694 cm–1（烯烃CH2-伸缩振动）、1 070 cm–1（多糖C-O拉伸）。而施四种有机肥引起了土壤DOM的官能团不同先后顺序的响应，分别为：WSB处理的土壤DOM官能团随培养时间变化的先后顺序为：1 070 cm–1（多糖C-O拉伸）、694 cm–1（烯烃CH2-伸缩振动）、970 cm–1（Si-O-Al官能团）、1 200~1 280 cm–1（羧基C-O拉伸和O-H变形）；SW处理的依次为：694 cm–1（烯烃CH2-伸缩振动）、1 170 cm–1（脂肪族-OH的C-OH拉伸）、1 070 cm–1（多糖C-O拉伸）、1 280 cm–1（羧基C-O拉伸和O-H变形）；SM处理的依次为：1 070 cm–1（多糖C-O拉伸）、1 280 cm–1（羧基C-O拉伸）、694 cm–1（烯烃CH2-伸缩振动）、1 442 cm–1（芳香族N=O拉伸）；而SP处理的依次为1 442 cm–1（芳香族N=O拉伸）、1 070 cm–1（多糖C-O拉伸）、694 cm–1（烯烃CH2-伸缩振动）、1 280 cm–1（羧基C-O拉伸）、970 cm–1（Si-O-Al官能团振动）。结果分析显示，四种施肥处理相较于CK，同步和异步光谱图中识别的自动峰和交叉峰的数量增加，表明施肥使土壤DOM随时间变化参与的官能团数量有所增加。且施用有机肥使多糖C-O拉伸和烯烃CH2-官能团先于羧基的C-O拉伸和O-H变形发生变化，这与CK的官能团响应顺序恰好相反。
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表 2 红外光谱吸收峰及其归属 Table 2 FTIR absorption peak and attribution |
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注：红色代表正相关，蓝色代表负相关；颜色强度越高表示正相关或负相关越强。 Note: Red represents positive correlations and blue represents negative correlations; higher color intensity indicates a stronger positive or negative correlation. 图 3 从不同培养期不同施肥处理的土壤DOM的FTIR的1 800~650 cm–1区域生成的同步和异步二维相关光谱（2D-COS）图 Fig. 3 Synchronous and asynchronous 2D-COS maps generated from the 1800–650 cm−1 regions of soil DOM FTIR spectra of different fertilization treatments in different culture periods |
培养结束时（第90天）5种不同处理下土壤DOM的C 1s NEXAFS光谱图如图 4所示，土壤主要有机碳官能团的相对含量如表 3所示。有机碳官能团主要划分为芳香碳、酚类碳、脂族碳、羧基碳、氧烷基碳和羰基碳六类。表 3显示，经过90 d的培养，不同处理下有机碳官能团相对含量存在差异。CK处理下的土壤有机碳主要以脂族碳和氧烷基碳为主，SW处理与CK相比，主要增加了芳香碳、羰基碳等碳官能团的相对含量，减少了脂族碳和氧烷基碳含量；SM处理增加了酚类碳、脂族碳含量，减少了羧基碳、氧烷基碳和羰基碳含量；SP处理增加了芳香碳、酚类碳、脂族碳含量，减少了羧基碳、氧烷基碳和羰基碳含量；WSB处理增加了脂族碳、氧烷基碳和羰基碳含量，减少了芳香碳、酚类碳、羧基碳含量。综上所述，除WSB处理外，其余三种有机肥处理均增加了土壤芳香碳、酚类碳而减少了氧烷基碳和羰基碳。而对于脂族碳，除SW处理显示出减少外，其他三种施肥处理均表现为增加。
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注：G1~G6分别表示芳香碳、酚类碳、脂族碳、羧基碳、氧烷基碳、羰基碳。下同。 Note: G1~G6 represents aromatic carbon, phenolic carbon, alkyl carbon, carboxylic carbon, o-alkyl carbon, carbonyl carbon respectively. The same below. 图 4 不同施肥处理下土壤DOM的碳近边X射线吸收精细结构光谱图 Fig. 4 Fine structure spectra of carbon near-edge X-ray absorption in soil DOM under different fertilization treatments |
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表 3 不同施肥处理下土壤DOM的碳近边X射线吸收精细结构光谱的半定量分析 Table 3 Deconvolution results for fine structure spectra of carbon near-edge X-ray absorption in soil DOM under different fertilization treatments |
施用有机肥在分解前期能显著提高土壤DOM含量，而随着分解的进行土壤DOM含量则波动下降。赵海超等[30]研究表明，施肥不仅是土壤DOM的重要来源，同时也通过影响微生物及作物根系活力促进土壤DOM的耗损，因此，施肥对土壤DOM具有双重作用。王艮梅等[31]的研究结果表明，在腐解前21 d，绿肥、猪粪处理均能显著提高土壤DOM含量；卢萍等[10]通过田间试验研究发现，在小麦秸秆施用后2个月左右，土壤溶液中DOM的浓度显著提高，这与本研究结果（图 1）类似。前期，由于有机肥本身含有大量的DOM，施入土壤中使得DOM含量增加；而在后期，DOM中含有的单糖、多糖、氨基酸等多种有机组分，在土壤中极易受微生物活动的影响而发生生物降解，随着时间的推移，土壤中微生物的新陈代谢，加上一部分被土壤矿物吸持，土壤DOM含量即表现为逐渐下降的趋势[32-33]。而不同处理间DOM含量的差异则主要与有机肥自身的种类和性质有关[34]。
3.2 不同来源有机肥分解对土壤DOM荧光组成的影响DOM是土壤微生物及作物根系利用的主要有机质形态。研究表明土壤中DOM不仅受有机肥和植物残体输入的影响[35]，而且受到土壤微生物的影响。其中，外源增施有机肥能够增强土壤中DOM的腐殖化程度和陆源性[14]。本研究中，5种处理下的土壤DOM均以C1组分占比最高（图 2），即微生物转化的类胡敏酸荧光组分含量较高。随着培养时期进行，尤其在第15天以后，四种施肥处理下的土壤DOM的C2组分（难降解的类胡敏酸荧光组分）占比均高于CK（图 2），原因可能为外源添加有机物料增加了土壤中分子结构相对复杂的芳香族化合物的比例，使土壤DOM的芳香性、疏水性、分子量和腐殖化程度增加。以往有研究[36]表明，施用有机肥能使DOM的芳香性及腐殖化程度增高，疏水占比以及分子量增加，DOM更趋于稳定。高忠霞等[13]在研究不同培肥处理下土壤DOM含量及特性时也发现了化肥配施有机肥或秸秆能够增加土壤DOM结构相对复杂的芳香类物质的占比，与本研究结果一致。
结合平行因子分析，本研究中5种不同处理后的土壤DOM均未识别出类蛋白荧光组分（图 2），产生该现象的原因主要是土壤DOM容易与土壤中的金属离子等形成络合物，络合物中的氢键可能导致荧光物质产生淬灭现象[24]。本研究中的供试土壤为矿区周边的土壤，铅（Pb）含量较高为225.6 mg·kg–1，因此，DOM中的蛋白类物质极大程度上与Pb发生了络合，从而导致荧光淬灭，再加上蛋白类组分中的酪氨酸的荧光效率低且易受水的拉曼峰干扰，所以类酪氨酸荧光峰亦不易被检测到[37]。
3.3 不同来源有机肥分解对土壤DOM分子官能团的影响本研究评估了2D-FTIR-COS在1 800~650 cm–1范围内的DOM最有用信息出现的位置[18]。2D-FTIR-COS结果表明，施入不同来源有机肥使得土壤DOM官能团数量增多，且随培养时间变化的先后顺序也不同（图 3），这可能与有机肥本身材料的性质有关。已有研究[34]表明，来源于陆地植物材料、牲畜粪便、海藻和骨粉的不同有机肥料释放的DOM具有典型的不同分子特征。具体而言，在WSB、SP处理中均出现了硅铝酸盐等土壤纳米矿物类官能团的响应信号（图 3和表 2），可能是激发了土壤纳米矿物与有机官能团的结合。添加WSB、SW和SM处理中土壤DOM的烯烃或多糖类碳先于芳香性或羧酸碳对分解时间发生响应（图 3），这与CK和SP处理中土壤DOM的芳香性或羧酸碳先于烯烃与多糖类碳组分发生响应不同。这可能是施用WSB、SW和SM给土壤DOM带来大量的不稳定有机物，包括多糖类物质和不饱和脂肪族等，从而优先被降解或转化[38]。而且DOM的芳香性和羧酸碳已被证明易与土壤中的矿物络合而被吸持在矿物上暂时保存起来[39]，随着分解时期的进行，在特定条件下部分被释放出来。
土壤DOM的C 1s NEXAFS结果（图 4和表 3）显示，除WSB处理外，其余三种施肥处理与CK对比均增加了土壤芳香碳、酚类碳的相对百分比而减少了氧烷基碳和羰基碳。对于脂族碳，除了SW处理显示出百分比减少外，其他三种施肥处理均表现为增加。彭义等[40]研究发现，免耕施肥处理有利于土壤芳香碳和脂肪族碳的积累；陈曦等[41]的研究结果也表明长期秸秆还田能显著提高土壤有机质中芳香碳含量，本研究结果与其类似。C 1s NEXAFS结果与EEM-PARAFAC结果（图 2）一致，即施用有机肥能增加土壤DOM中结构相对复杂的芳香类物质，免于被生物或微生物降解，从而保存于土壤中。
4 结论本研究通过多元光谱分析阐述了土壤DOM在四种来源有机肥不同分解阶段的分子组成差异。EEM-PARAPAC结果表明，培养结束后四种有机肥处理与对照相比增加了土壤DOM中难降解的类胡敏酸组分，减少了类富里酸物质，使土壤DOM的芳香性和腐殖化程度有所增加。C 1s NEXAFS与EEM-PARAPAC结果均表明施用有机肥增加了土壤DOM中结果相对复杂的芳香类物质。2D-FTIR-COS分析表明WSB和SP处理出现了铝硅酸盐等土壤纳米矿物类官能团响应信号；且添加WSB、SW和SM处理组中土壤DOM的烯烃或多糖类碳先于芳香性或羧酸碳组分对分解时间发生响应；与CK和SP处理中土壤DOM的芳香性或羧酸碳先于烯烃与多糖类碳组分发生响应不同。上述结果可增强对不同来源有机肥分解影响土壤DOM分子特征的了解，为进一步理解施入有机肥对土壤碳固存的影响、修复土壤污染物等问题提供理论指导。
致谢 感谢中国科学院高能物理研究所软X射线实验站（BSRF，BL4B7B）的工作人员赵晓娟、李嘉良等在C 1s NEXAFS光谱测量工作中给予的帮助。
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