2023, Vol. 60
钾是植物生长必需的营养元素，其丰缺状况会对作物产量造成直接影响[1]。施用化学钾肥是提高土壤钾素生物有效性的重要途径，但我国钾矿资源紧缺，化学钾肥产量有限，钾肥对外依存度高达50%以上[2]。然而土壤中其实并不缺乏钾源，我国土壤中全钾含量一般为0.5~25 g·kg–1，但可供植物直接吸收利用的钾素仅占全钾的1%~2%[3]，为改善该状况，通常在土壤中接种解钾菌以提高土壤钾素生物有效性和促进作物生长[4]。解钾菌不仅具有通过活化土壤生物酶类提高土壤速效养分的能力，还能通过调节植物体内吲哚乙酸激素水平和养分供应途径直接对植物生长发挥促生作用，也可通过活跃土壤微生物生态系统和拮抗作用来抵制病原菌对植物的危害而间接促进植物生长[5]。然而，单一地施用解钾菌进入土壤，其存活率通常会大幅下降[6]。生物质炭因其孔隙结构复杂、吸附力强、改良酸性土壤pH、具有生物膜网络结构等特点被认为是解钾菌的最佳载体材料之一[7]。因此，研究二者的配合施用效果有益于缓解我国钾素供给压力，为进一步利用土壤丰富的钾素资源、挖掘土壤供钾潜力提供一定的理论依据。
土壤酶是一种生物催化剂，是土壤肥力和土壤养分循环的重要表征指标[8]。当前，较多采用蔗糖酶、脲酶和酸性磷酸酶活性分别表征土壤碳、氮和磷养分的循环与供应状况，过氧化氢酶分解产生的水和氧可供土壤生命体（包括微生物）所需[9]。接种解钾菌菌株因其可提高植物根系活力从而可显著提高土壤脲酶、酸性磷酸酶、转化酶和多酚氧化酶等的活性[10]。生物质炭则因其特殊的理化性质、较大的比表面积及多孔结构可以为微生物生存与繁殖提供良好的栖息环境，使得参与养分循环的土壤酶量也相应增加，从而提高酶活性，但其颗粒表面的-COOH、-OH等官能团也能够改变酶的官能团结构或活性位点从而降低酶活性[11]。土壤微生物是根际生态系统中最为活跃的部分，其在土壤养分形成、转化和循环方面发挥重要作用，也是影响根际土壤钾素周转的重要因素之一[12]。外源功能微生物的施用虽然会改善土壤微生态环境，但会与土著微生物竞争营养物质和生态位，且该竞争在土壤营养物质缺乏的条件下越发激烈[13]，从而导致微生物群落结构发生变化。同时，微生物群落结构对生物质炭施入的响应由于受其制备原材料、制备温度、施用量和土壤本身性质的影响也有所不同[14]。据统计，全国23%的耕地严重缺钾，土壤钾素匮乏已成为限制作物产量和品质的影响因子之一[15]，而在钾素逐渐匮乏过程中外源功能微生物和生物质炭的施用对土壤酶活性与微生物群落结构的影响尚未可知，因此，研究生物质炭负载解钾菌对土壤酶活性和微生物群落结构的影响有利于反映钾素耗竭过程中土壤肥力高低、生化过程强度和土壤微生态系统稳定性的动态变化状况。
基于此，本研究基于黑麦草盆栽耗竭试验，提出如下科学假设：（1）生物质炭负载解钾菌对土壤酶活性会有明显的促进作用；（2）生物质炭负载解钾菌会对土壤细菌群落和土壤养分产生积极的影响。针对上述科学假设，拟采用高通量测序技术探究在土壤钾素逐渐匮乏过程中二者施用对土壤细菌群落的影响，进而通过冗余分析探究土壤酶活性、黑麦草产量、土壤化学和生物性质与土壤细菌群落的相关性，以期为功能性微生物与生物质炭的维护和改善土壤生态系统功能提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤：2020年3月于雅安市老板山农田区域（29°58'12"N，102°58'34"E）采集酸性紫色土，其基本理化性质与魏巍等[16]一致。
供试微生物：由茶园根际土壤分离纯化，经生理生化特性检测，16S rRNA序列分析比对，确定该菌种为微嗜酸寡养单孢菌（Stenotrophomonas sp. Ab27），属革兰氏阴性菌，该菌株已送往中国典型培养物保存中心保存（保藏编号：CCTCC No：2021355）。
供试黑麦草：品种为进口多年生黑麦草（Lolium perenne L.）。种子于40℃温水搅拌浸泡过夜，去除上层干瘪种子，加入3%的H2O2浸泡0.5 h，洗净并称取1.4 g置于培养皿中，于25℃培养箱培养48 h后进行移栽。
供试生物质炭：采购自浙江长三角聚农科技开发有限公司，采用玉米秸秆在厌氧环境以450~ 50℃，烧制2 h。其pH为9.58，全磷6.43 g·kg–1，全钾8.38 g·kg–1，碱解氮60.3 mg·kg–1，有效磷130.2 mg·kg–1，速效钾326.5 mg·kg–1；生物质炭表面元素组成采用飞纳台式扫描电镜能谱一体机（Phenom-world B.V./Phenom Prox，荷兰）测定，其元素组成为C 76.72%、O 15.78%、N 4.73%、P 2.5%、K 0.05%、S 0.22%。
供试肥料：尿素（N 46.2%）、过磷酸钙（P2O5 12%）和氯化钾（K2O 60%）。
生物质炭负载解钾菌复合材料：生物质炭与LB液体培养基以1︰100（w/v）的比例混合后，将微嗜酸寡养单孢菌（Stenotrophomonas sp. Ab27）接入溶源性培养基（LB培养基）进行活化，然后按照接种量与液体培养基以1︰20（v/v）的比例进行培养，培养12 h后，用磷酸盐缓冲液（0.01mol·L–1，pH 7.2）洗涤、离心，再冷冻干燥，得到生物质炭负载解钾菌的复合材料。
1.2 试验设计本研究设空白（CK）、施用化学钾肥（KCl）、接种解钾菌（KSB）、施用生物质炭（BC）、施用生物质炭负载解钾菌（BC-KSB）5个处理。CK处理为不施钾肥的空白对照，KCl处理施加0.4 g氯化钾，KSB处理施加20 mL的解钾菌液（1×109 cfu·mL–1），BC处理施加20 g生物质炭，BC-KSB处理施加20 g生物质炭负载解钾菌复合材料（1×109 cfu·g–1），除KSB处理外，其余四个处理均施加20 mL灭菌后的解钾菌液，每个处理三次重复。采用塑料桶（直径15 cm，高度15 cm）种植黑麦草，每桶装2 kg风干土，连续种植5茬，每茬在种植前均会施加基准计量的氮磷肥（N 0.40 g·pot–1、P2O5 0.3 g·pot–1）。生长期间定期浇无菌水，保持土壤水分在田间持水量的75%左右，大棚培养温度保持在10~30℃之间。在每茬种植30 d后进行收获，测定黑麦草干物质量，并采集15 g盆栽土壤，在手动移除土壤中的植物碎屑和残根后进行土壤酶活性的测定。第五茬黑麦草收获后的土样不仅测定其土壤酶活性，同时还测定土壤基本理化性质，另有部分储存于4℃冰箱送往上海凌恩生物科技有限公司进行高通量测序。
1.3 土壤样品分析测定每茬收集的土样采用靛酚蓝比色法、磷酸苯二钠比色法、3，5-二硝基水杨酸比色法和高锰酸钾滴定法分别测定其脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性[17]；土壤化学性质参照鲍士旦[18]的方法，微生物生物量碳和微生物生物量氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法（FE）测定[19]。
1.4 DNA提取与PCR扩增使用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，美国）试剂盒提取样本微生物总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。细菌群落结构采用16S rRNA全长通用引物27F 5’-AGRGTTYGATYMTGGCTCAG-3’和1492R5’-RGY TACCTTGTTACGACTT-3’进行PCR扩增[20]。20 μL反应体系包括：5×高保真缓冲液4 μL，dNTPs 2 μL，正反向引物0.8 μL，高保真DNA聚合酶0.4 μL，DNA模板10 ng，补双蒸水至20 μL。PCR扩增程序包括：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，25个循环；72℃ 10 min。PCR产物经过纯化回收、质量检测合格后委托上海凌恩生物科技有限公司完成建库及测序工作。
1.5 数据处理与分析 1.5.1 土壤微生物高通量测序与分析原始数据已上传至美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（SRA accession number：PRJNA876764）。使用SMRT Link Analysis软件6.0版处理PacBio原始reads，以获得环形一致性序列（CCS）reads：参数设置最小通过次数为3，最小预测准确度为0.99。原始reads通过SMRT Portal处理，以筛选序列的长度（< 800或 > 2 500 bp）和质量。通过去除barcode、引物序列、嵌合体和包含10个连续的相同碱基的序列进行进一步过滤。使用UPARSE将分类操作单元（OTU）以98.65%的相似性阈值聚类，并使用UCHIME去除嵌合序列。RDP Classifier对Silva Release138.1 16S rRNA数据库使用70%的置信度阈值分析每个16S rRNA基因序列的系统发育关系。进行物种组成分析和α多样性分析前，以最低的OTU序列数组别为标准进行抽平处理。
1.5.2 α多样性指数计算基于高通量测序的OTU数据，使用Mothur v1.35.1计算细菌α多样性指数，利用香农（Shannon）指数和辛普森（Simpson）指数表征细菌的群落多样性，香农指数越高，微生物多样性越高；辛普森指数越高，微生物多样性越低；利用Chao1指数和多度覆盖的物种估计量（abundance-based coverage estimator，ACE）指数表征细菌的群落丰富度，Chao1指数值越高代表群落物种越丰富，ACE指数是利用稀有物种估算物种多样性的指数，其值越高代表群落物种种类越丰富。以上多样性指数的计算参照何芝等[21]的方法。
1.5.3 作图与分析利用MeA绘制热图，利用Origin2022进行冗余分析（RDA）和绘图，采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），统计学检验方法采用邓肯（Duncan）检验法（P < 0.05）。
2 结果 2.1 生物质炭负载解钾菌对土壤酶活性的影响不同处理下土壤脲酶活性整体上随着种植茬数的增加表现出先增后减的变化规律（图 1a）。与CK、KCl和KSB处理相比，BC-KSB处理土壤脲酶活性在连作五茬中均显著提升（82.68%~475.86%）（P < 0.05），但与BC处理无显著差异。对于土壤酸性磷酸酶活性（图 1c），BC-KSB处理相比CK、KSB和BC处理，其在连作五茬中均可显著提高土壤酸性磷酸酶活性（23.25%~85.07%）（P < 0.05），但从第二茬开始其酸性磷酸酶活性才显著高于KCl处理（P < 0.05）。土壤蔗糖酶活性和土壤过氧化氢酶活性在种植过程中的变化特征相似，均随种植茬数的增加而降低（图 1b，图 1d），BC-KSB处理相比CK处理显著提升了土壤蔗糖酶和过氧化氢酶活性（P < 0.05），但与KCl、KSB和BC处理相比无显著差异。总之，BC和KSB配施更有利于土壤酶活性的提高。
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注：CK：不施钾肥的空白对照；KCl：化学钾肥；KSB：接种解钾菌；BC：施加生物质炭；BC-KSB：施用生物质炭负载解钾菌复合材料。图中不同小写字母代表相同茬数不同处理间差异显著（P < 0.05）。下同。 Note: CK: control; KCl: chemical potassium fertilizer; KSB: inoculation of potassium solubilizing bacteria; BC: application of biochar; BC-KSB: application of potassium solubilizing bacteria loaded biochar composite. Different small letters in the figure indicate significant differences among different treatments with the same number of harvest(P < 0.05). The same below. 图 1 不同施肥处理下土壤酶活性随收获茬数的动态变化 Fig. 1 Dynamic change characteristics of soil enzyme activity with the harvest number under different fertilization treatments |
土壤细菌α多样性指数中仅辛普森指数在各处理中差异显著（P < 0.05，表 1）。KSB处理的辛普森指数最高而香农指数最低，说明KSB相比其他处理会导致细菌群落多样性的降低。BC处理香农指数最高并且提升了ACE指数，说明生物质炭的施用可提高细菌群落的多样性和物种的丰度。BC-KSB处理Chao1指数和ACE指数最高且香农指数最大，表明BC-KSB处理下土壤细菌群落丰富度最高且可提高细菌群落多样性。
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表 1 不同施肥处理下土壤细菌α多样性指数 Table 1 The α diversity index of soil bacteria under different fertilization treatments |
解钾菌和生物质炭施用会导致土壤微生物组成发生改变（图 2）。在不同施肥处理的土壤中共检测出29个细菌门，其中相对丰度均大于1 %的共有细菌门15个。以共有的优势菌门（相对丰度大于3%）进行分析，CK和KCl处理各细菌门类相对丰度较为一致。KSB处理相较于CK和KCl处理增加了酸杆菌门（Acidobacteriota）和WPS-2的相对丰度，同时也降低了变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteriota）和浮霉菌门（Planctomycetota）的相对丰度。BC和BC-KSB处理相较于CK和KCl处理，提高了绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Proteobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetota）的相对丰度，但也降低了变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和WPS-2的相对丰度。
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图 2 不同施肥处理在门水平上对土壤细菌群落组成的影响 Fig. 2 Effect of different fertilization treatments on soil bacterial community composition at the level of phylum |
根据细菌属水平的丰度结果，采用Z-score标准化方法对丰度排名前30的菌属进行归一化处理并绘制了土壤细菌属水平群落结构组成热图（图 3a）。结果表明，不同处理相比CK均对土壤细菌群落造成不同程度的扰动，土壤细菌群落结构发生了变化，其中KSB处理明显增加了鞘脂单胞菌属（Sphingomonas）和IMCC26256菌属等的丰度，相对降低了罗河杆菌属（Rhodanobacter）、伯克氏菌属（Burkholderia）、芽孢杆菌属（Bacillus）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等的丰度；BC和BC-KSB处理明显增加芽孢杆菌属（Bacillus）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）等土壤优势菌属的丰度，相对降低了罗河杆菌属（Rhodanobacter）、伯克氏菌属（Burkholderia）和酸杆菌属（Acidobacteriales）等土壤优势菌属的丰度。
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注：图a）排名前30细菌优势属在不同施肥处理下的丰度聚类热图；图b）不同施肥处理与细菌优势属的物种对应关系图。 Note: Figure a)abundance clustering heat map of the top 30 bacterial dominant genera under different fertilization treatments; Figure b)corresponding relationship between different fertilization treatments and species of bacterial dominant genera. 图 3 生物质炭负载解钾菌对土壤微生物群落结构的影响 Fig. 3 Effects of potassium solubilizing bacteria loaded biochar on soil microbial community structure |
选择在不同处理土壤样品中相对丰度均超过1 %的土壤细菌优势属进行具体分析，包括8种：罗河杆菌属（Rhodanobacter）、伯克氏菌属（Burkholderia）、酸杆菌属（Acidobacteriales）和Occallatibacter菌属、Gemmataceae菌属和Isosphaeraceae菌属、JG30-KF-AS9菌属和WPS-2菌属。具体而言，不同施肥处理均促使土壤罗河杆菌属的相对丰度发生了明显的下降（图 3b），其下降幅度为：BC-KSB > BC > KSB。酸杆菌属和WPS-2菌属相对丰度的演变趋势较为一致，均为KSB处理高于CK，但其余三个处理低于CK。不同处理下伯克氏菌属的相对丰度则为：BC-KSB > KCl > CK > BC > KSB。JG30-KF-AS9菌属相对丰度在BC处理最高，在BC-KSB处理最低。Isosphaeraceae菌属和Occallatibacter菌属的相对丰度演变趋势较为一致，均为BC和BC-KSB处理的相对丰度最高。Gemmataceae菌属相对丰度在KCl处理中最高，其次表现为：BC-KSB > BC > KSB。
2.5 生物质炭负载解钾菌对黑麦草产量和土壤生物与化学性质的影响各施肥处理相比CK均显著提升了黑麦草干物质量（P < 0.05），但以BC-KSB处理对黑麦草产量的提升最大（表 2）。相比CK和KCl处理，BC处理显著提高了土壤pH（P < 0.05），但与KSB和BC-KSB处理无显著差异；KSB处理显著提高了有机质的含量（P < 0.05），相比CK和KCl处理增幅分别为75.40%和62.96%；BC和BC-KSB处理均能显著提高有机质、全氮、速效钾、微生物生物量碳和微生物生物量氮的含量（P < 0.05）；但土壤全钾和全磷含量在各施肥处理间无显著差异。
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表 2 不同施肥处理下第五茬黑麦草干物质量和土壤生物与化学性质 Table 2 Dry weight of ryegrass and soil biological and chemical properties of the fifth crop under different fertilization treatments |
利用冗余分析探讨了最后一茬13种环境因子（脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、微生物生物量碳、微生物生物量氮、pH、有机质、全氮、全磷、全钾、速效钾和黑麦草干物质量）与土壤细菌优势属的关系。结果（图 4）表明，RDA的前两个轴分别解释了总方差的78.49%和16.48%，共解释了94.97%，说明RDA分析结果可靠。有机质、速效钾、脲酶、酸性磷酸酶和微生物生物量氮是影响细菌属水平的主要环境因子，有机质、速效钾、脲酶和酸性磷酸酶与伯克氏菌属呈正相关，与罗河杆菌属呈负相关；微生物生物量氮与伯克氏菌属和罗河杆菌属均呈负相关，其余细菌优势属对土壤化学与生物性质响应不同且较弱。同时，分析结果也表明，黑麦草的生长主要受伯克氏菌属和罗河杆菌属的影响较大。
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注：Ace：酸性磷酸酶；Sue：过氧化氢酶；Ure：脲酶；Cae：蔗糖酶；Rr：罗河杆菌属；Ba：伯克氏菌属；As：酸杆菌属；Or：Occallatibacter菌属；Ge：Gemmataceae菌属；Ie：Isosphaeraceae菌属；J9：JG30-KF-AS9菌属；W2：WPS-2_norank菌属。黑色线条代表环境影响因子，灰色线条代表微生物物种。 Note: Ace: Acid phosphatase; Sue: Sucrase; Ure: Urease; Cae: Catalase; Rr: Rhodanobacter; Ba: Burkholderia; As: Acidobacteriales; Or: Occallatibacter; Ge: Gemmataceae; Ie: Isosphaeraceae; J9:JG30-KF-AS9;W2:WPS-2_norank. Black lines indicate environmental impact factors, gray lines indicate microbial species. 图 4 土壤细菌群落与土壤生物和化学性质的冗余分析（RDA） Fig. 4 Redundancy analysis(RDA)of soil bacterial community and soil biological and chemical properties |
土壤酶活性强弱可反映土壤生化过程强度[8]。研究结果表明，单施解钾菌会提高土壤脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶的活性（图 1），这可能是因为解钾菌具有生物防治的作用，施用后一方面可以抑制作物病虫害、诱导植物系统产生抗性，同时还可改善微生物根际区系和提高植物根系活力，产生更多的酶进入土壤，从而提高土壤酶活性[22]。本研究中解钾菌的施入会降低罗河杆菌属（致病菌）和变形菌门（包含大量致病菌）相对丰度的结果（图 2和图 3）也证实了这一点。生物质炭的施用增加了所有酶的活性（图 1），这与Duan等[23]的研究一致。但也有研究发现，生物质炭施入土壤会造成土壤酶活性的降低。刘遵奇等[24]研究发现逐年施加生物质炭降低了土壤脲酶和过氧化氢酶活性。冯爱青等[25]研究发现施加黑炭抑制了过氧化氢酶和中性磷酸酶活性。这可能与生物质炭特殊的理化性质有关，生物质炭丰富的孔隙结构能够储存大量的水分和养分，为微生物提供了良好的生存环境，促进了微生物活性，提高酶活性；也由于其具有强力吸附性，掩盖酶促反应位点，从而降低酶活性[12]。本研究结果表明，生物质炭负载解钾菌对4种土壤酶活性提升最大（图 1），这说明生物质炭负载解钾菌对土壤酶活性的提升具有协同作用。相关学者对生物质炭和外源功能微生物的研究也证实了两者配施会对土壤酶活性产生积极的协同作用，如Heidari等[26]研究发现，施用牛粪生物质炭和溶磷菌处理对红花的脱氢酶和脲酶活性具有明显的提升作用。Cui等[27]研究发现生物质炭与复合有效微生物的联合添加对土壤蔗糖酶、脲酶和碱性磷酸酶具有显著的改善作用。这可能是由于生物质炭能够吸附反应底物，提高酶活性，而外源功能微生物施入土壤会改变土壤的微生态环境，进而影响土壤酶活性。
3.2 生物质炭负载解钾菌对土壤微生物多样性的影响土壤是微生物的生活场所，土壤养分的丰缺状况会影响土壤细菌多样性。本研究发现KSB处理降低了物种的丰富度，却增加了菌群的均匀度（表 1）。这可能是由于KSB的施入会与土著微生物发生竞争，这种竞争随着营养物质的匮乏而变得更为激烈[13]，从而导致竞争双方中一方的丰度减少甚至消失。同时，本研究表明，施加生物质炭可以提高细菌的α多样性和菌群丰富度（表 1），这与Yao等[28]研究结果一致。生物质炭对于细菌α多样性具有重要作用，其表面分布有能够吸附容易矿化有机碳和NH4+的官能团，从而为微生物提供了丰富的能源，并且生物质炭本身富含碳元素，适量的外部碳源能刺激细菌的生长和繁殖[29]。此外，本研究还表明BC-KSB处理对土壤细菌α多样性表现出积极的促进作用（表 1），这可能与生物质炭本身所含丰富的营养物质有关，在营养物质充足的情况下，KSB与土壤微生物的竞争作用减弱，对土壤微生物的积极影响放大。
3.3 土壤细菌群落结构对生物质炭负载解钾菌的响应微生物群落的相对丰度、微生物量的变化以及土壤中的特殊微生物类群（指示生物）可用来间接反映土壤微生态系统的稳定性。本研究添加的微嗜酸寡养单孢菌属于变形菌门（Proteobacteria），变形菌门为本研究土壤中最优势菌门，但KSB和生物质炭的单独施用均降低了变形菌门的相对丰度（图 2）。变形菌门是最大的细菌门类，包含大肠杆菌、沙门氏菌以及霍乱弧菌等诸多病原菌，其相对丰度下降可能是由于生物质炭会通过增加其他与变形菌门有竞争关系的微生物群落数量来降低变形菌门的丰度；此外，变形菌门与土壤pH具有很强的相关性[30]，本研究土壤为酸性紫色土，对土壤理化性质的测定结果表明，施加KSB和生物质炭均造成了土壤pH的升高（表 2），因此，也有可能是土壤pH的变化导致了变形菌门相对丰度的降低。绿弯菌门包含热微菌和光合细菌，在高温环境中可利用氧气生长繁衍，在无氧环境中也可利用光进行光合作用，具有较好的生物解磷作用[31]。放线菌门具有生物解磷和固定氮素的作用，也有研究表明其丰度的增加可抑制病害的发生，促进土壤养分循环[32]。本研究中BC和BC-KSB处理均提高了绿弯菌门和放线菌门的相对丰度，而KSB处理却降低了二者的相对丰度（图 2）。说明单施生物质炭和生物质炭与解钾菌的配施均可提高土壤生物解磷作用、固碳和固氮能力，并且减小土壤致病菌对植物的威胁，而KSB可能正如前文所言，在营养条件缺乏的条件下，其与绿弯菌门和放线菌门的竞争导致了两者的丰度下降。酸杆菌门适宜生活在酸性贫瘠环境，BC处理和BC-KSB处理均降低了酸杆菌门的相对丰度（图 2），这可能与生物质炭含有丰富的养分和对土壤pH提升作用有关[12]，同时，土壤酸杆菌门相对丰度下降使得其他细菌门竞争压力减小，有助于提高其他细菌门相对丰度。值得注意的是，本文高通量测序中并未检测出施加的微嗜酸寡养单孢菌，但施加KSB的处理对该土壤细菌微生物群落结构造成了明显的影响（图 3a），这可能是KSB的施加虽然对土壤微生态产生了积极的影响，但由于土壤pH等化学性质的变化和连作次数的增加，施加进去的KSB数量逐渐减少直至消失。因此，为了提高KSB的存活率，应该在每茬结束后，下一茬种植前补充施加一定数量的KSB，以更好地探究KSB对土壤微生物多样性和群落结构的影响。
在属分类水平上，罗河杆菌属（Rhodanobacter）为最优势菌属，罗河杆菌属归属于变形菌门，本研究表明，生物质炭和KSB均可抑制罗河杆菌属的相对丰度，其相对丰度按KSB、BC、BC-KSB处理的顺序梯度下降（图 3b）。相关研究表明，罗河杆菌属是一种植物病原菌，田程等[33]研究发现罗河杆菌属与西瓜枯萎病的发生呈正相关。说明KSB和生物质炭的施用可降低病原菌的相对丰度，并且二者配施效果最好。伯克氏菌属（Burkholderia）具有影响植物激素水平进而刺激作物生长的功能，并且具有共生固氮能力，但有研究表明伯克氏菌属也包括有致病菌种，会造成洋葱腐烂，观赏性花卉出现根腐烂、叶斑和花枯萎等症状，如Padhi等[34]通过对柑橘黄龙病的研究，结果发现伯克氏菌在健康树根中的含量较染病的根中低。本研究细菌丰度聚类热图结果表明，生物质炭和解钾菌的单施和配施均会降低伯克氏菌属的相对丰度（图 3a），并且二者单施也会降低其相对丰度，但是二者混施却会增加其相对丰度（图 3b）。这可能是由于生物质炭与解钾菌的配施虽然提高了伯克氏菌属中具有固氮功能菌株的活性，但抑制了伯克氏菌属中致病菌株的活性，因而整体上仍降低了伯克氏菌属的相对丰度。本研究也发现生物质炭与解钾菌的配施会提高土壤中芽孢杆菌属和慢生根瘤菌属的丰度（图 3b），芽孢杆菌属具有解磷解钾的能力，是一种重要的有益微生物，能增强植物抵御外界环境变化的能力[35]。慢生根瘤菌属具有共生固氮能力，能促进作物的根系生长和发育[36]。综上，生物质炭与解钾菌的配合施用能促进土壤有益菌群的繁殖而抑制致病菌群的繁殖。
3.4 土壤生物和化学性质与细菌群落结构的关系土壤为微生物群落生长繁殖提供微环境，其理化性质又间接影响土壤微生物群落结构的组成[37]。生物质炭负载解钾菌可显著提高有机质、速效钾和微生物生物量氮的含量（表 2），本研究通过RDA分析表明，细菌群落结构与有机质、速效钾、脲酶、酸性磷酸酶和微生物生物量氮密切相关（图 4）。有机质、速效钾和酸性磷酸酶是土壤细菌群落的主要驱动因子（图 4），这与已有研究[38]相一致。酸性磷酸酶和脲酶分别是磷和氮相关的水解酶，二者与土壤速效养分有很强的相关性，土壤养分状况又会直接影响微生物活性。微生物生物量氮是土壤氮库活跃的生物组分，直接驱动微生物参与氮养分循环。土壤pH在本研究中对土壤细菌群落影响不明显（图 4），这可能是因为施肥处理在整个种植周期未造成土壤pH发生较大改变，本研究中除BC处理土壤pH显著提高，其余处理之间均无显著差异（表 2）也证实此观点。
4 结论与空白对照相比，单施生物质炭和解钾菌均可明显提高土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和过氧化氢酶活性，而生物质炭负载解钾菌可显著提高该四种酶的活性。同时，生物质炭负载解钾菌也可提高土壤微生物的多样性与均匀度，对土壤细菌群落造成影响，提高土壤有益菌群（绿弯菌门、放线菌门、芽孢杆菌属和慢生根瘤菌属）的丰度，抑制土壤有害菌群的繁殖（变形菌门和罗河杆菌属），显著提高黑麦草产量、微生物生物量碳、微生物生物量氮、有机质、全氮和速效钾含量。冗余分析表明有机质、速效钾、微生物生物量氮、酸性磷酸酶和脲酶是影响土壤细菌群落结构的主要限制因子。可见，生物质炭负载解钾菌对于培肥土壤、改良土壤生态系统具有积极的意义，可以更好地推动生物有机肥的开发利用。
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