2024, Vol. 61
2. 湖北省农业科学院果树茶叶研究所, 武汉 430209;
3. 中国农业科学院郑州果树研究所, 郑州 450009;
4. 贵阳小河区金海农业科技开发有限公司, 贵阳 550000;
5. 黑龙江省农业科学院园艺分院, 哈尔滨 150069;
6. 河北省农林科学院昌黎果树研究所, 河北昌黎 066600;
7. 江苏省农业科学院果树研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室, 南京 210014
2. Institute of Fruit and Tea, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430209, China;
3. Zhengzhou Fruit Research Institute, CAAS, Zhengzhou 450009, China;
4. Guizhou Xiaohe District Jinhai Agricultural Science and Technology Development Co., Ltd., Guiyang 550000, China;
5. Horticulture Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, China;
6. Changli Institute of Pomology, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Changli, Hebei 066600, China;
7. Institute of Pomology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China
梨是我国仅次于苹果、柑橘的第三大栽培果树，根据联合国粮农组织2019年1月的最新统计数据显示，截至2017年底我国梨栽培面积约96万hm2 [1]。枝条修剪整形是梨树栽培和管理的重要技术手段，保证了树体营养的合理分配、果实产量和品质的提升[2]。据估算，我国梨园每年修剪产生的枝条约161万~242万t[2]，其体积庞大，收集、运输、处理等费工费时。随意弃置或焚烧等传统处理方式易污染环境。梨树修剪枝条含有丰富的纤维素、木质素、糖类、脂肪及各种无机养分[2]，是重要的农业资源。修剪枝条的资源化利用已成为梨园生产管理的重要内容之一。尽管果树枝条与菌剂、畜禽粪便等混合堆肥技术不断发展[3]，但堆肥需要特定的处理场所，堆置时间长、占用空间大，且枝条离田费工，在一定程度上限制了其大规模推广应用。而将枝条粉碎后直接覆盖还田成本低、操作简单，且可减少梨园杂草生长，改善梨园土壤质量[4]。
土壤表层覆盖果树枝条能够阻止阳光直射，降低地表温度，减少水分蒸发，同时枝条腐解后的有机碳等其他物质可增加土壤有机质和矿质养分，对提升土壤质量具有重要意义[5-6]。研究表明，苹果枝条夏季直接覆盖还田、冬季将枝条成段埋土覆盖还田均有利于增加土壤有机质和矿质养分含量，提高土壤酶活性[7]；冬季适量梨枝条粉碎覆盖还田能显著提高梨园土壤矿质元素和有机质含量，有效改善土壤酸化状况，增加土壤真菌数量及其相关土壤酶活性，提高果实品质[8]。但果树枝条覆盖是否调控了土壤中关键的微生物类群尚不得知。此外，研究表明土壤中的原生生物（以原生动物为主）在影响土壤微生物群落结构和养分转化上发挥关键作用[9]，是衡量土壤质量的重要生物指标之一[10]。但果树枝条覆盖是否调控了土壤中微生物群落（包括原生生物）尚未可知，土壤养分是否驱动了土壤微生物组结构的变化也有待进一步研究。
本研究选择国家梨产业技术体系5个示范县典型梨园（贵州毕节、河北昌黎、黑龙江哈尔滨、湖北枝江和河南许昌），研究不同地区梨树修剪枝条直接覆盖对土壤微生物群落及土壤养分的影响，探究梨树枝条覆盖对土壤微生物的影响是否存在普遍规律，为枝条覆盖还田提供科学依据。本研究预期可为调控梨园土壤微生态环境的土壤管理体系提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 样品采集2019年9月9日—9月30日，分别对国家梨产业技术体系5个示范县的梨园土壤进行采样，地点信息如下：贵州毕节（27°11' N，105°17' E）、河北昌黎（39°42' N，119°5' E）、黑龙江哈尔滨（45°72' N，126°57' E）、湖北枝江（30°17' N，114°7' E）和河南许昌（33°54' N，113°42' E）。5个地区梨园土壤理化性质如表 1所示。梨树品种均为当地的主栽品种，冬剪时将梨树修剪枝条粉碎成2~3 cm的小段，直接覆盖于梨树行间，覆盖量为7 500 kg·hm–2，枝条修剪时叶片已凋落，枝条覆盖年限为：毕节，2年；昌黎，2年；哈尔滨，2年；枝江，1年；许昌，1年。以不覆盖枝条为对照。每个梨园的枝条覆盖较为均匀，管理方式较为一致，所以每个地点随机选择3行覆盖和3行未覆盖枝条的树下采集土壤样品。采集0~5 cm和5~20 cm土层土样考察覆盖对不同深度土壤的影响。采样时先去除地表覆盖物，多点采集不同土层土样，共获得60个土样，每个土样500 g。采集的土样分为3份，一份直接保存于–80 ℃冰箱用于提取土壤DNA，检测土壤微生物组结构；一份用于直接测定土壤
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表 1 梨园土壤理化性质 Table 1 Soil physicochemical properties in peach orchards |
土壤pH利用混合电极pH计测定（PE-10，Sartorious，德国）；土壤有机质采用油浴加热—重铬酸钾容量法测定；土壤铵态氮和硝态氮利用流动分析仪（Auto Analyzer 3，德国）测定；土壤有效磷采用钼锑抗比色法测定；土壤速效钾利用NH4OAc浸提—火焰光度法测定。
1.3 土壤酶活性测定土壤脲酶和蔗糖酶活性测定方法分别参照微量法土壤脲酶（S-UE）活性检测试剂盒和蔗糖酶（S-SC）活性检测试剂盒（Solarbio，北京）中说明书。
1.4 土壤DNA提取及扩增子测序参照PowerSoil DNA提取试剂盒（Mo Bio，Carlsbad，CA，美国）说明书提取土壤DNA，用NanoDrop（ThermoScientific，Wilmington，DE，美国）检测DNA的质量（A260/A280）和浓度。采用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对细菌16S rRNA基因V4区进行PCR扩增[11]。采用引物ITS1（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）扩增真菌的ITS区域[12-13]。采用引物V4_1f（CCAGCASCYGCGGTAATWCC）和TAReukREV3（ACTTTCGTTCTTGATYRA）对原生生物18S rRNA基因V4区进行PCR扩增[14-15]。最终扩增用的上游引物包括合适的Illumina接头、pad linker及基因特异性引物，下游引物包括Illumina接头、pad linker、基因特异性引物及6 nt barcode。PCR包含35个循环，扩增条件为：98℃ 1 min预变性，98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min。PCR扩增产物使用QIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN，德国）纯化，并使用Qubit®2.0 Fluorometer（Invitrogen，美国）对纯化产物定量，样品采用Illumina MiSeq平台进行测序（凌恩生物信息技术有限公司，上海）。
1.5 序列处理扩增子测序结果采用UPARSE标准处理流程降噪，利用Mothur软件对UPARSE处理获得的代表序列和可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）表进行后续分析，具体方法参照Gu等[16]。测序深度统一至序列数最少的样品的测序量。16S rRNA OTU的分类经RDP 16SrRNA classifier比对获得[17]，ITS OTU分类利用UNITE真菌数据库进行注释[18]，18S rRNA OTU的分类经PR2数据库比对获得[17]，确定分类地位，置信度阈值设为80%。
1.6 数据分析基于归一化的种水平物种丰度表，利用R 4.0.3中vegan包进行基于Bray-Curtis相似性矩阵的主坐标轴分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）；对土壤微生物群落结构进行置换多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PMANOVA），以评估覆盖与未覆盖处理土壤微生物群落结构的差异。为挖掘枝条覆盖土壤中的潜在关键微生物，采用R包RandomForest构建随机森林模型[19]。从本试验60个土壤样品中随机选择42个样品建立模型选择丰度分别为前200的细菌、真菌和原生生物的OTU组成一个新的矩阵，在OTU水平上建立判别模型。其余18个样品用于验证模型的准确性。用十倍交叉验证并重复三次以评估土壤微生物对于判定样品分类的准确性。试验数据采用Microsoft Excel 2013、R 4.0.3进行ANOVA方差分析、邓肯多重检验（Duncan’s multiple range test，P≤0.05）的分析。
2 结果与讨论 2.1 梨树枝条粉碎覆盖对土壤养分及酶活性的影响本研究首先比较了梨树修剪枝条粉碎覆盖与对照处理不同土层的土壤pH、铵态氮、硝态氮、速效钾、有效磷、有机质以及蔗糖酶和脲酶活性等理化特性，结果如图 1所示。梨树修剪枝条覆盖对土壤理化特性的影响存在地区差异，如昌黎、哈尔滨和枝江点的土壤pH在覆盖处理中更高，但毕节点处理之间无显著差异，许昌点则呈现相反趋势。总体而言，枝条覆盖可提高土壤有机质含量，昌黎、哈尔滨、枝江点差异显著；提高土壤有效磷含量，昌黎、哈尔滨和许昌点差异显著；显著提高枝江点速效钾含量。覆盖后哈尔滨和枝江点土壤蔗糖酶和脲酶活性均显著提高。不同深度土层相比较，0~5 cm土层中硝态氮、有机质、蔗糖酶较高。大量研究表明土壤表层的有机覆盖物经微生物分解后直接进入土壤，从而增加土壤有机碳的固存[20]。矿质养分在地区间、土层间及覆盖处理间无一致变化趋势与修剪枝条生长年限、矿质养分含量和木质素含量有关，也与覆盖年限、当地气候条件有关。研究表明，梨树剪枝中的氮、磷、钾含量均随枝条生长年限的增加而降低[2]。同时，不同地区特殊的气候，如温度、降水等影响枝条降解速率[21-22]。因此，为了更有效利用修剪枝条以提升果园土壤的肥力，仍需要评估不同生长年限枝条、不同覆盖量以及不同环境因素对梨树枝条覆盖后土壤理化性状的影响。
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注：ns表示差异不显著；*、**、***和****分别表示在P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001和P < 0.0001的水平上有显著的差异；n=9。图中的缩写如下：BJ，毕节；CL，昌黎；HR，哈尔滨；ZJ，枝江；XC，许昌；SC：蔗糖酶，UE：脲酶；CK：对照（不覆盖枝条），Mul：枝条覆盖处理。下同。 Note: ns, no significant; *, **, *** and **** indicate statistical significance at P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 and P < 0.0001 levels; n=9(Duncan's Multiple Range Test); BJ for Bijie City, CL for Changli City, HR for Harbin City, ZH for Zhijiang City, XC for Xuchang City. SC: Saccharase, UE: urease. CK: control(no mulching), Mul: mulching. The same below. 图 1 梨树枝条粉碎覆盖对不同土层的土壤理化特性和土壤酶活性的影响 Fig. 1 Effects of pear pruning branches mulching to the physicochemical properties and soil enzyme activities at different soil depths |
为了探究枝条覆盖对土壤微生物群落的影响，采用扩增子测序对土壤细菌、真菌及原生生物群落进行研究。首先分析土壤细菌、真菌及原生生物群落的结构（PCoA分析），结果如图 2所示。相较于对照处理，覆盖枝条后显著影响土壤细菌、真菌和原生生物群落结构，且5个采样点基本呈现一致趋势。覆盖梨树枝条后，哈尔滨地区不同土层土壤的细菌群落、毕节和枝江不同土层土壤的原生生物群落在统计学上有显著差异。本研究还比较了同一果园不同土层中土壤微生物群落的差异，结果发现0~5 cm和5~20 cm之间无显著差异，未来研究可关注覆盖后结合秋施基肥对中下层土壤（20 cm以下）的影响，因为表层土壤和底层土壤中的微生物对土壤生态系统的功能同等重要[23-24]。
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注：Sd：土壤深度，T：处理。 Note: Sd: Soil depth, T: Treatment. 图 2 梨树枝条粉碎覆盖对土壤微生物群落结构的影响（主坐标分析（PCoA）） Fig. 2 Effects of pear pruning branches mulching to the structure of soil microbial communities (principal co-ordinates analysis, PCoA) |
以香农指数为例，比较不同地点覆盖梨树枝条对土壤微生物群落α多样性的影响，如图 3所示，覆盖梨树枝条对土壤细菌、真菌和原生生物群落多样性的影响无一致趋势，如显著增加了枝江地区的细菌群落、毕节和枝江地区的原生生物群落的香农指数；降低了许昌地区的细菌群落、哈尔滨地区的真菌群落和昌黎地区的原生生物群落的香农指数；但对大多数采样点的细菌、真菌和原生生物群落无显著影响。说明梨树枝条覆盖尚未对土壤微生物群落多样性形成明显的影响，可能与覆盖的年限较短（1~2年）以及不同地区特定的环境气候有关。土壤中丰富的微生物参与了覆盖枝条的分解转化，与土壤质量和肥力密切相关[25]。本研究发现覆盖枝条显著改变了土壤微生物群落结构，但对大部分地区微生物多样性无显著影响（图 3）。这可能是因为枝条富集了具有分解木质纤维素能力的微生物类群，使土壤中的微生物趋同。
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图 3 梨树枝条粉碎覆盖对土壤微生物群落多样性的影响 Fig. 3 Effects of pear pruning branches mulching on the diversity of soil microbial communities |
对5个采样点梨树枝条覆盖与对照处理土壤细菌、真菌和原生生物在门水平的物种组成进行了差异比较。细菌群落中，以变形菌门为优势物种，其丰度在不同处理中波动变化，但总体上梨树枝条覆盖处理中变形菌门的相对丰度高于对照处理；酸杆菌门和放线菌门为次优物种，除了HE和XC两个地区，其他三个地区中酸杆菌门在覆盖处理中的相对丰度高于对照，而放线菌门在对照处理中更高（图 4a）。真菌群落中，以子囊菌门为绝对的优势菌门，除了枝江点，其他4个采样点的覆盖处理中的子囊菌门相对丰度均低于对照处理；其次为担子菌门，同样除了枝江地区，其他4个采样点的覆盖处理中担子菌门的相对丰度均高于对照处理（图 4b）。原生生物群落中，后鞭毛生物为优势物种，对照处理略高于覆盖处理；其次为有孔虫界和囊泡虫类，二者在梨树枝条覆盖处理中的相对丰度略高于对照处理（图 4c）。本研究发现同一采样点梨树枝条覆盖与对照处理间土壤微生物群落结构和组成的差异小于不同采样点间的差异（图 4）。这可能是因为不同地区复杂的生物和非生物因素共同塑造了特定的土壤微生物群落。综上所述，梨树枝条覆盖影响了4个地区的土壤微生物群落组成，以及其中一些物种（门水平）的相对丰度，进而可能影响土壤养分转化和利用效率。
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图 4 梨树枝条粉碎覆盖对土壤微生物群落门水平物种组成的影响（a. 细菌群落物种组成，展示了丰度前9的细菌门的相对丰度；b. 真菌群落物种组成，展示了丰度前8的真菌门的相对丰度；c. 原生生物物种组成，展示了丰度前9的原生生物门的相对丰度） Fig. 4 Effects of pear pruning branches mulching on the composition of soil microbial communities at the phyla level(a. relative abundances of top 9 bacterial phyla; b. relative abundances of top 8 fungal phyla; c. relative abundances of top 9 protist phyla) |
为了探究能否利用土壤微生物作为生物标记菌预测样品来自枝条覆盖还是对照处理，利用机器学习的随机森林方法分析两组处理的土壤微生物组。从交叉验证误差曲线可以看出，当使用60个OTU时，模型曲线的错误率趋于稳定，故选择对模型重要性最高的前60个OTU作为生物标记菌（图 5a）。如图 5b所示，展示了重要性前30的物种，这些生物标记菌中以细菌和真菌为主，具体分类信息见表 2。30个关键物种中有20个物种在梨树枝条覆盖处理中的丰度显著高于对照，8个显著低于对照，2个无显著差异。细菌以变形菌门为主（13个），且属于变形菌门的所有物种在覆盖处理中的丰度均显著高于对照，包括Acidibacter、Xanthobacteraceae、Nitrosomonadaceae等，说明这些菌株受梨树枝条覆盖的正向驱动，这些细菌可能是降解枝条的潜在微生物。Fu等[26]发现Acidibacter在施用菜籽饼和绿肥的土壤中显著富集，促进了秸秆的降解，指示了土壤养分变化。有研究表明在秸秆还田土壤中Xanthobacteraceae和Nitrosomonadaceae丰度与土壤有机碳含量呈正相关[27]；而Nitrosomonadaceae可促进铵态氮向硝态氮转化，加速秸秆分解[28]。与前人研究中发现秸秆类有机物的降解过程以真菌为主导[29-30]不同，本研究挖掘了一些与枝条降解有关的细菌资源，未来有望应用于梨树枝条堆肥的研究中。真菌以子囊菌门为主（8个），包括Gibellulopsis、Phialophora、Podospora等，但不同处理中的丰度无一致变化。在该模型中，原生生物的贡献相对较小，说明短期的梨树枝条覆盖对土壤原生生物的影响不明显。
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注：对梨树枝条覆盖和不覆盖下土壤微生物组（共60个样品）在OTU水平进行了分类。a. 十折交叉验证错误率；b. 随机森林分类模型中生物标记菌按照对模型准确度的重要性由高到低排序，展示重要性排前30的生物标记菌；c. 利用随机森林分类模型对覆盖与不覆盖做分类预测。该模型基于土壤微生物组成判断样品的来源，上方样品（灰色方块）为对照组，下方样品为枝条覆盖处理，其中灰色表示样品来源被预测为对照土壤，黑色则是预测为枝条覆盖处理的土壤。 Note: The soil microbiome(60 samples in total)with or without mulching pear branches was classified at the OTU level. a. error of 10 fold cross validation. b. the biomarkers in the random forest classification model were sorted in order of importance to the accuracy of the model, and the top 30 biomarkers were displayed. c. the random forest classification model was used to make classification predictions for mulching and no mulching treatments. The model determines the source of the sample based on the soil microbial composition. The upper samples(square in grey)are the control(without mulching). The lower samples are mulching treatment, of which the grey color indicates that the sample is predicted to be the control soil, and the black color indicates that the sample is predicted to be the mulched soil. 图 5 基于土壤微生物组的随机森林分类模型精准预测梨树枝条粉碎覆盖下土壤微生物的关键物种 Fig. 5 Random-forest classification model precisely predicted the keystones in soil microbial communities under pear pruning branches mulching |
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表 2 梨树枝条粉碎覆盖后土壤中微生物的关键物种信息 Table 2 Information of the keystones in soil microbial communities under pear pruning branches mulching |
随机森林根据自助采样方法，对于每个决策树大约三分之二的样本用于训练，另外三分之一的样本作为袋外数据用于性能评估和计算袋外数据误差。经优化后的袋外预测误差（out-of-bag estimate of error rate）减小至2.38%，说明显示分类器模型的精准度很高，可有效识别两类分组。用建模之外的18个样品验证模型的准确性（图 5c），其中来自对照处理的9个样品均被准确预测，而覆盖处理的9个样品仅有1个预测错误，准确率高达94.44%。利用该分类模型可较为精准地根据关键物种的丰度预测样品来自覆盖还是对照处理，说明梨树枝条覆盖后的土壤中一些重要的生物标记菌在不同采样点具有较高的一致性。
2.5 土壤理化特性对土壤微生物群落组成的影响冗余分析（redundancy analysis，RDA）发现土壤理化特性和土壤酶活等因子均显著影响细菌、真菌和原生生物的群落结构（图 6，置换检验，P = 0.001）。细菌群落的第一和第二轴分别解释了39.13%和23.72%的变异度，真菌群落的第一和第二轴分别解释了32.07%和27.23%的变异度，原生生物群落的第一和第二轴分别解释了37.60%和18.61%的变异度。从图中可以看出，不同采样点和覆盖处理微生物群落之间有明显的聚类，说明采样点和枝条覆盖均显著影响了土壤的细菌、真菌和原生生物群落结构。进一步分析土壤理化因子对土壤细菌、真菌和原生生物群落的影响，结果发现不同采样点有不同的主导因素，如毕节梨园的细菌和原生生物群落主要受土壤有机质含量的影响，枝江梨园的细菌和真菌群落主要受铵态氮影响。整体而言，pH和有效磷（AP）是影响不同梨园土壤细菌群落的2个主导因子（pH：F = 10.98，P < 0.001；有效磷：F = 8.73，P < 0.001）；有效磷（AP）和速效钾（AK）是影响土壤真菌群落的2个主导因子（有效磷：F = 10.97，P < 0.001；速效钾：F = 7.70，P < 0.001）；有效磷（AP）和pH是影响土壤原生生物群落的2个主导因子（有效磷：F = 9.61，P < 0.001；pH：F = 5.21，P < 0.001）。而梨树枝条覆盖处理显著增加了土壤有机质、有效磷、速效钾等养分的含量，可能进一步影响了覆盖土壤中的微生物群落组成和结构。
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图 6 土壤微生物群落与土壤理化特性的冗余分析（RDA）（a. 细菌群落；b. 真菌群落；c. 原生生物群落） Fig. 6 Redundancy analysis(RDA)of the microbial communities and soil physicochemical properties(a. bacterial community; b. fungal community; c. protist community) |
结果还发现土壤速效磷对土壤微生物群落的影响最显著（图 6）。研究表明相较于其他覆盖物，果树枝条覆盖可减少土壤磷的流失[31]，土壤有效磷含量增加[32]。本研究也发现3个采样点（昌黎、哈尔滨、许昌）中覆盖梨树枝条后显著提高了土壤有效磷的含量（图 1），土壤中活化的磷可能进一步影响了梨园土壤的微生物群落。前人研究表明土壤中添加磷可增加土壤微生物生物量，改变土壤微生物群落组成[33-34]，与本文结果一致。土壤中磷的可利用性也可改变土壤真菌结构及其与木质纤维素降解相关酶的活性[35]，该部分结果有待进一步探究。
进一步通过斯皮尔曼相关性分析探究梨粉碎枝条处理中，富集的土壤微生物类群（OTU水平）与土壤理化特性之间的相关性，相关性系数r > 0（正相关）且P < 0.05的结果如图 7所示。结果表明，土壤有机质含量与细菌B_OTU34（Microscillaceae属，r = 0.62）和真菌F_OTU38（Coprinopsis属，r = 0.60）相对丰度相关性较强，土壤pH和土壤脲酶活性与细菌B_OTU4（Proteobacteria门，r = 0.55和0.61）相对丰度相关性较强，而土壤有效磷含量与真菌F_OTU1（Phialophora属，r = 0.56）相对丰度具有较好的相关性。土壤有机质含量与细菌B_OTU34相关性最强。
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图 7 梨树枝条粉碎覆盖处理下土壤微生物群落（OTU水平）与土壤理化特性的斯皮尔曼相关性 Fig. 7 Spearman correlations between soil microbial community(OTU level)and physicochemical properties under pear pruning branches mulching |
本研究初步评估了梨树枝条覆盖对土壤的影响，发现覆盖在土壤表层的粉碎梨树枝条增加了土壤有机质含量；由于覆盖时间较短，对土壤微生物群落多样性无显著影响，但改变了细菌和真菌群落结构，土壤有机质与Microscillaceae属类群细菌的相关性最强。未来还需增加样品采集数量和覆盖地区，进一步评估不同地区梨树枝条覆盖对土壤物理、化学、生物等性质影响的规律。此外，覆盖枝条对果实产量和品质的影响还有待随覆盖年限递增持续追踪，其影响的机制也有待进一步探究。总体而言，本研究解析了参与梨树枝条降解和养分转化一些重要的潜在关键细菌和真菌类群，为未来筛选高效降解梨树枝条的微生物菌株提供了方向理论依据。
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