2024, Vol. 61
表1(Table 1)
2. 河南农业大学环境与资源学院, 郑州 450002
2. College of Environmental and Resource Sciences, Henan Agriculture University, Zhengzhou 450002, China
二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和氧化亚氮(N2O)是大气中最重要的温室气体，对温室效应的产生具有极大贡献[1]。大气中大量的温室气体排放来源于土壤，土壤微生物作为土壤生态系统的基本组成部分，对土壤温室气体的排放有极大影响。尽管土壤生态系统中存在数以千计的微生物类群，但大多数处于休眠状态。为了识别土壤元素循环过程真正起作用的活性微生物，稳定性同位素核酸探针技术(DNA-SIP)被广泛应用[2]。相较于基于13C和15N的SIP，18O与16O的同位素质量差更大，使得标记和未标记组分物理分离更加容易。同时，细胞维持和生物合成对水的普遍需求使得H218O-SIP能够识别所有生长的活性微生物[3]。更重要的是，H218O可以在不添加额外物质的情况下识别土壤中的活性微生物，使得实验条件更接近于真实的原位环境[2]。
稻田生态系统作为地球上最大的人工湿地，经长期淹水培育而成，具有利用H218O标记的天然优势[2]。虽然水稻培育过程大部分处于淹水状态，但也存在排水晒田再灌溉的干湿变化过程。研究发现干湿变化显著改变了细菌群落结构，其中革兰氏阳性细菌呈增长趋势，而革兰氏阴性细菌呈减少趋势[4]。干湿变化也对温室气体排放产生巨大影响，例如干燥的稻田土壤在偶发性降水事件后产生大量的CO2 [5]。有研究进一步发现，干湿变化有利于反硝化过程的发生和产甲烷菌的生长，因而排放更多的N2O和CH4[6-7]。然而，大多数研究只是关注整体微生物群落和温室气体排放的变化，对真正起作用的活性微生物的研究较少。此外，以往研究大多是基于长时间尺度对其进行分析，但同时有研究显示干湿交替会对土壤温室气体排放在短期内产生显著影响[5-7]。因此，本研究在检测短时间内干湿变化下温室气体排放和整体细菌群落变化的基础上，应用基于18O的DNA-SIP技术，分析活性细菌群落的变化趋势，以期为深入了解稻田土壤活性细菌群落结构、群落构建过程和潜在功能对干湿变化的响应，为实现温室气体减排提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 土壤样品概况土壤样品采自于浙江长兴(31°00′N，119°55′E)水稻田，属于人为水稻土。该地区属亚热带季风气候，年均气温为15.6℃，年均降水量为1 309 mm。该水田的主要作物为梗稻，为一年两熟稻田。2018年6月，选取三个样地(6 m×6 m)使用土钻进行五点法混合取样，取样深度为0~20 cm。土壤样品装入冰盒当天带回实验室，将新鲜土样置于4 ℃冷库保存，取部分新鲜土样风干研磨后过4 mm筛，进行土壤理化性质的测定。
在土水比为1︰2.5条件下用pH计测量土壤pH。土壤有机质采用重铬酸钾容量法测定。全氮和碱解氮的测定分别采用凯氏定氮法和碱解扩散法。溶解有机碳由TOC分析仪测定，土壤与水的比例为1︰5。土壤有效磷采用碳酸氢钠进行提取，并用钼蓝法进行测定。土壤速效钾采用乙酸铵进行提取，用火焰光度计分析。测得土壤理化性质如下：pH 6.90±0.08，全氮1.01±0.05 g· kg–1，有机质13.5± 0.1 g· kg–1，可溶性有机碳116±2 mg· kg–1，碱解氮52.4±1.5 mg· kg–1，速效磷9.04±0.15 mg· kg–1，速效钾64.0±1.0 mg· kg–1。
1.2 温室气体检测与SIP微宇宙培养实验温室气体检测培养实验设置干旱(D，50%田间最大持水量)，湿润(W，100%田间最大持水量)和干湿变化(RW，从50%调到100%田间最大持水量)三个处理，D和W预培养六天后，将6个重复的D的含水量调到100%田间最大持水量，即RW。将相当于6.0 g干土的新鲜土壤样品转移至120 mL血清瓶中，调好土壤含水量后，胶塞加铝盖封口，25℃黑暗培养。其中预培养时D有九个重复，正式培养时D、W各三个重复，RW有六个重复。预培养结束时以及正式培养的每天对培养瓶内CO2、CH4、N2O浓度进行测定，正式培养0 d、3 d和7 d进行破坏性取样，保存在–80℃冰箱中，用以微生物分析。
SIP微宇宙培养实验是在温室气体检测培养实验正式培养时，对RW处理增加一个H218O的处理，18O-H2O处理(99 atom%，Sigma Aldrich，St. Louis，MO)用以分析土壤中干湿变化下的活性细菌，16O-H2O处理作为对照组，其他步骤同温室气体检测培养实验。
1.3 DNA提取和SIP分层将正式培养0 d、3 d和7 d的土壤样品用FastDNA Spin Kit for Soil(MP)提取土壤基因组总DNA。用0.7%的凝胶电泳检测DNA的完整性，NanoDrop® ND-2000 UV-Vis spectrophotometer(NanoDrop Technologies，Wilmington，DE，USA)检测DNA的质量和纯度。DNA样品–20℃冰箱保存，其中16O3dRW、18O3dRW、16O7dRW以及18O7dRW等同位素标记的DNA样品(每个处理六个重复)用以进行超高速等密度梯度离心。
超高速等密度梯度离心具体操作方法如下：约3 μg DNA与4.9 mL氯化铯(CsCl)溶液混合，调节浮力密度为1.725 g· mL–1，之后将混合液转移至5.1 mL超高速离心试管中，调平密封后用贝克曼Vti65.2转子(Beckman Coulter Inc.，Palo Alto，CA，USA)在20℃条件下以177 000 g的速度离心44 h。离心结束后，收集14层DNA组分溶液并测定折光率。将分层后的DNA组分溶液用PEG6000和乙醇纯化，溶于30 μL TE缓冲液中用于后续实验分析[8]。
1.4 16S rRNA基因的定量PCR和Miseq测序将0 d、3 d和7 d的总DNA以及上述分层纯化后的DNA样品进行16S rRNA基因的定量PCR分析(LightCycler 480，Roche Applied Science)，具体引物信息为515F(GTGYCAGCMGCCGCGGTAA，5′~3′)、806R(GGACTACNVGGGTWTCTAAT，5′~3′)，相关PCR条件见参考文献[9]。反应体系20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，Dalian，China)，1 μL DNA模板(1~10 ng)，8 μL milli-Q水，体系中引物总浓度为0.5 μM。通过溶解曲线，检测荧光以确认PCR产物的特异性。本实验定量PCR扩增效率在89%~105%之间，R2值在0.990~0.999之间。
将0 d、3 d和7 d的总DNA以及第8层的DNA-SIP(包括轻重层)样品进行16S rRNA(V4) Miseq高通量测序，引物序列及扩增条件见文献[9]。测序得到的fastq文件通过Trimmomatic质量过滤后，用FLASH进行合并，保留长度大于200 bp，平均质量大于25的16SrRNA序列。对序列在97%相似度水平进行OTU(可操作分类单元)聚类，最后根据Silva数据库对OTU进行物种注释。全部DNA样品抽平后共有2 878 748个高质量序列，平均每个样品得到54 316个高质量序列。将所有DNA的测序数据上传至Genome Sequence Archive(GSA)数据库，检索号为CRA009634。
1.5 数据处理与分析本实验中所有数据分析利用Excel 2019，SPSS 26.0以及R(v3.6.3；http://www.r-project.org)完成，其中重复处理数据的标准误差由Excel中的STDEV.P函数计算得到。利用R语言的vegan包估算了alpha多样性指数，并利用双因素方差分析以及LSD事后检验计算各因素在处理间的显著性和协同效应。通过R包vegan和ggplot2采用主坐标分析(PCoA)将beta多样性的差异可视化，并用PERMANOVA分析定量评估各因素的影响。通过OTUs所对应的物种注释利用amplicon和reshape2计算总数前8物种门的相对丰度。
为了量化干湿变化条件下活性细菌群落构建与非活性细菌群落构建的差异，应用归一化随机率(NST)来评估细菌群落组装的潜在机制。NST是一个用于评估群落构建过程中生态随机性的指标，以50%为边界，大于50%以随机性为主导，而小于50%则以确定性为主导。本实验中NST指数基于cao、mGower距离矩阵计算，并进而对数据进行双因素方差分析和LSD检验，判断微生物活性和培养天数在重湿润细菌群落构建中的影响。
为了进一步比较干湿变化条件下活性细菌群落与非活性细菌群落以及不同培养天数条件下的潜在功能差异，通过Tax4fun预测了细菌群落的潜在功能。通过16S rRNA测序数据与KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能数据库的比对，显著识别细菌二级代谢通路。在计算各预测功能的相对丰度后，将不同处理间功能进行显著性差异分析(P < 0.05)。
2 结果 2.1 不同水分条件下稻田土壤的温室气体排放温室气体微宇宙培养实验发现不同含水率显著影响稻田土壤的温室气体排放速率(P < 0.05)。经过7天的微宇宙培养，湿润处理较干旱处理CO2(11020.55±321.00较8824.23±247.97 mg·kg–1·h–1，P < 0.001)与N2O(12.70±7.17较1.20±0.04 mg·kg–1·h–1，P=0.014)排放显著增加(图 1)。相较于干旱和湿润处理，干湿变化下显著促进了CO2(12786.22±470.93较11020.55±321.00，8824.23±247.97 mg·kg–1·h–1，P < 0.001)的排放，并且CH4(2.36±0.20较1.97±0.03，1.75±0.03 mg·kg–1·h–1)的排放也略有增加(图 1)。
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注：D代表含水量为50%田间最大持水量的土壤处理，W代表含水量为100%田间最大持水量的土壤处理，RW代表含水量从50%田间最大持水量调至100%田间最大持水量的土壤处理。误差棒由STDEV.P函数计算得到。 Note: D represents the treatment with 50% field maximum water capacity, W represents the treatment with 100% field maximum water capacity, and RW represents the treatment with 50% field maximum water capacity to 100% field maximum water capacity. The error bar is calculated by the STDEV.P function. 图 1 二氧化碳排放速率(a)、甲烷排放速率(b)和氧化亚氮排放速率(c)随培养时间的变化 Fig. 1 Carbon dioxide emission rate(a), methane emission rate(b), and nitrous oxide emission rate(c) were analyzed |
微宇宙培养实验中，稻田土壤总细菌群落的alpha、beta多样性以及群落组成如图 2所示。就alpha多样性而言，土壤含水率(P < 0.001)显著影响细菌的Chao1指数和Shannon指数，干旱和干湿变化处理下的Shannon指数显著高于湿润处理，细菌Chao1指数随培养时间(P=0.005)显著降低(图 2a，图 2b)。就beta多样性而言，土壤含水率、培养天数以及他们的协同效应均显著影响土壤细菌的beta多样性，其中土壤含水率的影响最大，解释了29.54%的细菌群落变化(图 2c)。
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注：不同字母表示总细菌群落alpha多样性(a-b)在各处理间的显著性差异(P < 0.05)。其中，***代表P < 0.001，**代表P < 0.01，*代表P < 0.05，NS代表P > 0.05。下同。 Significant differences in alpha diversity(a-b) of total bacterial community among treatments(P < 0.05) are indicated by letters. Respectively, *** represents P < 0.001, ** represents P < 0.01, * represents P < 0.05, and NS represents P > 0.05. The same as below. 图 2 总细菌群落alpha多样性(a-b)和总细菌群落beta多样性(c)，总细菌群落物种组成(d)分析 Fig. 2 Alpha diversity(a-b), Beta diversity(c), and species composition(d) of total bacterial communities were analyzed |
变形菌门(Proteobacteria)是稻田土壤总细菌群落中相对丰度最高的门，干旱、湿润、干湿变化下土壤变形菌门占总细菌相对丰度分别为29.75%±2.22%、35.27%±1.27%、31.08%±2.82%。绿弯菌门(Chloroflexi，16.83%±1.75%)和酸杆菌门(Acidobacteria，1.40%±0.71%)分别为总细菌群落中相对丰度第二和第三高的门。干湿变化下放线菌门(Actinobacteria，7.98%±1.06%)和浮霉菌门(Planctomycetes，3.97%±0.50%)的相对丰度显著高于干旱下放线菌门(7.06%±0.52%，P=0.013)和浮霉菌门(3.54%±0.29%，P=0.019)以及湿润下放线菌门(4.75%±0.32%，P < 0.001)、浮霉菌门(3.24%± 0.23%，P < 0.001)的相对丰度。变形菌门的相对丰度在0~3d的短期干湿变化内实现显著增长(29.50%±2.62%至33.11%±1.72%，P=0.047)。干湿变化处理下放线菌门(7.06%±0.44%至8.91%± 0.66%，P < 0.001)和浮霉菌门(3.67%±0.49%至4.28%±0.81%，P=0.038)的相对丰度随培养时间均显著增长。
2.3 DNA-SIP技术鉴定活性细菌SIP微宇宙培养实验中，DNA-SIP离心后每个样品分为14层，浮力密度在1.626~1.791 g·mL–1之间。将分层后的细菌DNA进行16S rRNA基因的定量PCR分析得到基因拷贝数，将每层的基因拷贝数与各层中最大的基因拷贝数作比，得到各层次的浮力密度梯度的分布图(图 3)。根据16S rRNA基因相对丰度的分布状况，选择了16O和18O标记的重湿润样品的重层DNA(8层)进行高通量测序，对干湿变化下的土壤活性细菌进行进一步分析。
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图 3 16S rRNA基因相对丰度在不同浮力密度上的分布 Fig. 3 Distribution of relative abundance of 16S rRNA genes at different buoyancy densities |
干湿变化下活性细菌群落的alpha、beta多样性以及群落组成如图 4所示。就alpha多样性而言，Shannon指数(P=0.038)在活性细菌和非活性细菌之间存在显著差异，且活性细菌的Shannon指数低于非活性细菌。培养天数(P < 0.001)显著影响Chao1指数，活性细菌Chao1指数随着培养时间呈现降低的趋势(图 4a，图 4b)。就beta多样性而言，细菌群落在重湿润状态下的培养天数、活性均存在显著差异(图 4c)。
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图 4 干湿变化下活性细菌群落alpha多样性(a-b)和活性细菌群落beta多样性(c)，活性细菌群落物种组成(d) Fig. 4 Alpha diversity(a-b), Beta diversity(c), and species composition(d) of active bacterial communities under rewetting were analyzed |
就群落组成来看，活性细菌群落中以变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)为主，各占活性细菌群落的42.02%±4.73%和18.34%± 0.21%。占变形菌门中相对丰度前三的三个目分别为Betaproteobacteriales(26.33%±3.25%)、Sphingomonadales(20.52%±4.92%)和Myxococcales(16.60%± 4.74%)。第7天的变形菌门相对丰度(44.38%± 4.79%)为第3天变形菌门(40.36% ± 2.24%)相对丰度的1.1倍，且变形菌门中的Myxococcales目的相对丰度也随着培养时间呈显著增加(13.04%± 0.54%到21.94%± 2.89%，P < 0.001)。Gaiellales、Micrococcales和Micromonosporales为活性细菌放线菌门中相对丰度前三的三个目，各占放线菌门的21.78%±3.44%、14.19%±2.12%和10.69%±1.84%。此外，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度随着培养时间呈显著上升(6.37%±1.15%至8.10%±0.37%，P= 0.021)。
2.5 活性细菌群落的构建与潜在功能为明确干湿变化下水稻土活性细菌群落的构建情况，通过NST分析进行评估。无论在NST.cao和NST.mGower中培养天数和细菌活性均对群落构建过程产生显著的影响，其中活性细菌群落构建则以确定性为主(NST.ij.mGower < 50%)，而非活性细菌群落构建以随机性为主(NST.ij.mGower > 50%)。活性细菌群落构建的确定性主导过程随着培养时间进一步加强(图 5)。
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注：*代表P < 0.05，NS代表P > 0.05。 Note: * represents P < 0.05, NS represents P > 0.05. 图 5 干湿变化下活性细菌的群落构建情况 Fig. 5 Assembly processes of the active bacterial community under rewetting |
对活性细菌进行Tax4fun功能预测，并利用KEGG数据库进行功能比对得到以下结果。预测得到的潜在功能主要包括代谢、有机系统、人类疾病、遗传信息处理、环境信息处理、细胞过程等六种一级功能，而在活性细菌中又以代谢功能基因占据绝对优势(相对丰度 > 75%)(表 1)。
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表 1 各处理中的Tax4fun预测功能相对丰度占比 Table 1 Relative abundances of Tax4fun predicted functions in each treatment |
对预测功能中的二级功能进一步进行差异性比较，发现活性和非活性细菌群落的潜在功能存在一定差异(图 6c、图 6d)。干湿变化下活性细菌的碳水化合物代谢潜在功能的相对丰度随着培养时间的延长显著降低(P < 0.05)。
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注：*代表P < 0.05。Note：* represents P < 0.05. 图 6 干湿变化下活性和非活性细菌在不同培养时间下的Tax4fun功能预测差异比较 Fig. 6 Comparison of Tax4Fun functional prediction differences between active and inactive bacteria under rewetting at different incubation times |
相较于干旱处理，湿润处理显著增加CO2排放(图 1a)，这可能与低含水量(50%田间最大持水量)会降低土壤微生物和酶活性，不利于呼吸有关[10]。湿润水稻土中N2O的排放显著高于干旱水稻土(图 1c)，这可能与100%田间最大持水量条件是适宜硝化和反硝化同时产生N2O的最佳含水量有关[11]。同时，干湿变化显著促进CO2排放(图 1a)。干湿变化下CO2的大量排放可能由以下两种机制导致：从生理上讲干湿变化条件下微生物细胞为维持渗透压平衡而快速消耗原先集中在微生物细胞中的胞内溶质有关；物理上指的是在土壤聚合体被润湿破坏后，受物理保护的有机碳暴露于微生物，从而迅速消耗掉有机碳并产生CO2[12]。并且干湿变化会打破原先的干燥条件，从而导致土壤理化性质和微生物可能会出现短期响应进而导致更多的温室气体排放[4]，例如CH4排放的增加可能是在干湿变化下产甲烷菌的更多繁殖导致的[7](图 1b)。
干湿变化下和干旱处理下细菌的Shannon多样性显著高于湿润处理下细菌的Shannon多样性(图 2a，图 2b)，这可能是因为长期湿润对土壤细菌多样性有负面影响[13]。同时beta多样性相关分析进一步揭示了培养时间和含水率对细菌群落结构产生显著影响(图 2c)。群落组成分析表明，变形菌门是稻田土壤细菌群落中占比最多的门，在湿润处理下占比最多，且在干湿变化的0到3d时间内显著增加(图 2d)。这与变形菌门更适应湿润条件，在这种情况下更有竞争力的繁殖策略有关，且变形菌是土壤生态系统重要代谢活动的关键驱动因素，可能对CO2的产生起到重要的推进作用[14-15]。研究进一步发现，干湿变化下放线菌门和浮霉菌门的相对丰度，显著高于干旱和湿润下放线菌门和浮霉菌门的相对丰度，且随着培养时间呈现显著增加(图 2d)。放线菌门相对丰度的上升可能是因为革兰氏阳性菌较起革兰氏阴性菌更能抵抗干湿变化的胁迫，放线菌门作为革兰氏阳性菌门更能抵抗干湿变化下胁迫的干扰[4]。浮霉菌门细菌主要为自养细菌，对养分需求较低，能够及时适应干湿变化下的缺氧环境，因此在干湿交替条件下相对丰度显著增加[16-17]。并且放线菌和浮霉菌分别具有产生次生代谢产物和同化胞外多糖的作用，可能对干湿变化下CO2排放的增加产生重要影响[18-19]。
3.2 干湿变化下活性细菌群落的多样性与组成本研究通过18O标记的水对干湿变化下水稻土壤中的活性细菌进行探究，并在3天和7天成功对18O标记的活性细菌进行了分离和测定(图 3)。干湿变化下变形菌门、放线菌门主导了活性细菌群落，这可能与变形菌门和放线菌门细菌具有广泛的生态位有关[20]。且第3天变形菌门相对丰度随着培养至第7天增加了12.8%，这主要是由Myxococcales在变形菌门的相对丰度随着培养显著增加导致的，因为相较于其他变形菌门中目水平上的细菌，Myxococcales具有较高的环境适应潜力和更广泛的捕食范围[21]。同时，芽单胞菌门也随着培养呈显著增加，这也可以归因于它们具备干湿变化下导致的低氧条件下的存活能力[22]。以上结果说明总体群落变化能一定程度反映活性微生物的生长趋势，但如果要深入探究活性微生物仍需通过SIP标记分离。
结果表明，干湿变化进一步导致了活性细菌与非活性细菌群落alpha、beta多样性的显著差异，这可能是干湿变化下快速增长的活性共养细菌的生长，进而竞争排斥其他细菌导致活性细菌群落变化的结果[23]。活性细菌alpha多样性(Chao1和Shannon指数)与培养时间呈负相关关系(图 4a、图 4b)。这是因为土壤活性细菌的生存偏好与其呼吸特性紧密相关，而大部分细菌为需氧菌，无法持续适应干湿变化所导致的淹水环境的厌氧条件的影响，且分离和孤立的微观世界也可能影响细菌的alpha多样性[24-25]。培养时间也对活性和非活性细菌的beta多样性产生显著影响(图 4c)，这表明随着时间的推移，干湿变化下的土壤可以通过环境对不同类群的过滤对微生物群落产生实质性的影响。
3.3 干湿变化下活性和非活性细菌群落的构建与功能预测根据群落构建的结果来看，非活性细菌群落以随机性为主导(NST.ij.mGower > 50%)，而活性细菌群落则以确定性为主导(NST.ij.mGower < 50%)(图 5)。这可能是因为相较于非活性细菌，活性细菌更容易受干湿变化和环境因子等确定性因素的限制，且物种分选强度可能随着细菌的代谢活性水平而增强，活性细菌相较于非活性细菌有着更强的代谢活性[20]，因此活性细菌群落构建由确定性过程所主导。第7天活性细菌群落构建的确定性过程较第3天更强，这可能是因为随着培养的进行，活性细菌多样性减少，而在低多样性群落中，确定性组装过程占主导地位[26]。此外，活性细菌的生长繁殖消耗了土壤养分，在限制性营养环境中群落构建以确定性为主[27]。
功能预测分析表明，活性细菌与非活性细菌的潜在功能存在显著差异，而活性细菌较非活性细菌与功能联系更加紧密[28]。根据干湿变化下的活性细菌功能预测情况，干湿变化下代谢是活性细菌最重要的潜在功能，这与活性细菌中占主导地位的变形菌门和放线菌门对代谢相关功能有着重要的促进作用的结果一致[15-18]。活性细菌中碳水化合物代谢潜在功能的相对丰度随着培养显著降低(图 6b)，这可以归因于干湿变化导致的100%田间最大持水量的淹水条件，降低了土壤中活性细菌的碳水化合物代谢[29-30]。
4 结论干湿变化下，土壤显著排放更多二氧化碳，并对细菌群落的多样性和组成产生显著影响。干湿变化下变形菌门、放线菌门、浮霉菌门随培养时间显著增加，而活性细菌群落中变形菌门和放线菌门细菌占据主导地位，这与干湿变化下总细菌群落的变化趋势较为一致。活性细菌群落构建以确定性为主导，且群落确定性主导过程随培养时间进一步加强。代谢功能是活性细菌群落最重要的预测功能，并且碳水化合物代谢预测功能的相对丰度随培养时间在活性微生物群落中呈显著下降。综上所述，干湿变化下水稻土排放更多以二氧化碳为主，变形菌门和放线菌门主导的活性细菌群落构建以确定性为主导，且表达以代谢功能为主导的潜在功能。
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