我国秸秆产量居世界首位，据统计，每年产生7亿~9亿吨的秸秆^[1-2]。一直以来，将秸秆归还土壤在农业生产中受到广泛应用，秸秆可以持续为后续种植作物提供重要养分^[3]。秸秆还田一方面可以通过碳矿化过程向土壤提供不稳定态碳源和其他养分，提升土壤肥力^[4]，减少化肥施用和环境污染；另一方面可以直接影响微生物群落的组成与结构，改变土壤核心物种群，提高微生物多样性和代谢活性，进一步促进微生物对有机物料的转化^[5]。研究表明，与不施肥和单施化肥相比，增施秸秆等有机物料可以提高土壤微生物的抗干扰能力，对微生物群落起到积极调控作用^[6]。因此研究秸秆还田对土壤养分和微生物群落的影响对实现农业生态系统的可持续发展至关重要。

土壤C/N是影响秸秆还田效果的重要因素。有研究表明，仅秸秆还田会破坏土壤C/N，使土壤微生物和作物处于“氮饥饿”状态^[7]。秸秆还田配施适量氮肥，能提高土壤氮含量，降低耕层土壤C/N，缓解微生物与作物氮素竞争矛盾，促进微生物生长活性和秸秆分解^[8]。相比于单施化肥，秸秆还田配施化肥是一项可持续的农业措施，可以缓解土壤酸化和质量下降问题，提高微生物多样性，促进与土壤碳、氮、磷循环相关的微生物生长^[9]。畜粪作为重要的有机肥，与化肥相比，其自身养分全面（含N、P、K等），且肥效期长^[10]。因此投入的氮肥种类，添加方式和添加量都会影响秸秆在田间的分解过程。

细菌作为土壤中最具活性的因子，占土壤微生物总量的70%~90%，在养分转化和秸秆分解中起着重要作用^[11]。土壤细菌种群间通过频繁地相互作用，在土壤环境中共享养分和生态位，形成了复杂的生态网络^[12]。目前对土壤细菌的研究多集中在其组成结构、多样性、功能分析以及与环境因子相关性上^[13]。而华北地区作为我国秸秆还田比例最高的粮食主产区^[14]，在长期不同秸秆还田方式和配施不同外源氮物料下，从分子生态网络的角度探索其养分与细菌群落互作关系的研究较少。

基于此，本研究依托中国科学院封丘农业生态实验站，采用16S rRNA高通量测序技术分析秸秆移除、秸秆掩埋分别配施不同氮肥条件下细菌群落结构和组成特征，应用网络分析构建细菌群落之间的分子生态网络和生态模块，建立养分与细菌群落、网络特征之间的关联，旨在揭示华北地区不同秸秆还田方式和配施不同氮肥量对土壤养分、细菌种间互作关系和网络共现模式的影响，阐明秸秆行间掩埋配施不同比例的氮肥促进秸秆降解过程的微生物机制，为提升潮土地力和秸秆的资源化利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验设计

采样点为位于中国科学院封丘农业生态试验站（35°01′N，114°32′E）的长期秸秆掩埋配施氮肥试验地。试验地气候类型为半干旱半湿润的暖温带季风气候，年平均气温13.9 ℃，年平均降水量615 mm，土壤类型为黄河冲积物潮土，种植模式为夏玉米–冬小麦轮作。2011年起设计3种秸秆还田方式、4个不同有机肥鸡粪或无机氮肥施用量梯度（分别为总施氮量的0%、8%、16%和24%）与秸秆一同行间掩埋，共12个处理。具体为T1：秸秆移除+PK肥；T2：秸秆覆盖+PK肥；T3：秸秆移除+NPK肥（100%无机氮肥）；T4：秸秆覆盖+NPK肥（100%无机氮肥）；T5：秸秆掩埋+NPK肥（100%无机氮肥）；T6：秸秆掩埋+8%有机氮+NPK肥（92%无机氮肥）；T7：秸秆掩埋+16%有机氮+NPK肥（84%无机氮肥）；T8：秸秆掩埋+24%有机氮+NPK肥（76%无机氮肥）；T9：秸秆掩埋+8%无机氮+NPK肥（92%无机氮肥）；T10：秸秆掩埋+16%无机氮+NPK肥（84%无机氮肥）；T11：秸秆掩埋+24%无机氮+NPK肥（76%无机氮肥）；T12：秸秆掩埋+促腐剂+NPK肥（100%无机氮肥）。试验中施用的肥料包括氮肥（210 kg·hm^–2），磷肥（P₂O₅ 157 kg·hm^–2）、钾肥（K₂O 105 kg·hm^–2）。小区面积40 m²（8 m×5 m），各小区四周使用1 m的深水泥隔离。供试土壤初始养分情况和各小区具体布置情况见文献[15]。

1.2 样品采集与分析

于2022年6月小麦成熟收获后，使用直径5 cm的土钻分别对各小区随机采集5个0~20 cm耕层土壤，混匀装入自封袋。所有样品置于保温箱，冰袋保鲜运回实验室。去除植物残体、石头等杂质后，过2 mm筛分装，一份保存于–80 ℃，用于DNA提取，另一份风干测定养分指标。土壤养分指标按照《土壤农业化学分析方法》^[16]进行测定。土壤pH使用pH计测定；土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾氧化–外加热法测定；全氮（TN）、全磷（TP）和全钾（TK）分别采用凯氏定氮法、硫酸–高氯酸消煮–钼锑抗比色法和氢氧化钠熔融–火焰光度法测定；硝态氮（${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$）和铵态氮（${\text{NH}}_{\text{4}}^ + {\text{ - N}}$）采用流动分析仪测定；有效磷（AP）采用碳酸氢钠浸提–钼锑抗比色法；速效钾（AK）采用乙酸铵提取–火焰光度计法。

1.3 土壤微生物群落高通量测序

土壤总DNA采用Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒（MP Bio，USA）提取；使用序列515F-907R引物组扩增细菌16S rRNA基因的V4~V5区，于Illumina MiSeq平台进行高通量测序；使用QIIME2软件包生成ASVs（Amplicon Sequence Variants）；通过Sliva数据库的rdp classifier方法对ASVs完成分类学注释（移除只有一条序列的ASVs）；以序列数最少的样品为标准重抽样；基于重抽样后数据完成后续分析。测序数据上传至NCBI Sequence Read Archive中，可通过序列号“PRJNA957048”获取。

1.4 数据分析

所有数据用Excel 2019整理，SPSS 27.0对处理进行单因素方差分析，并采用Duncan方法进行显著性检验（P < 0.05）。Chao1指数和Shannon指数采用R 4.2.2的‘microeco’包计算，用于表征细菌群落Alpha多样性。通过R 4.2.2计算处理间Bray-Curtis距离，并通过PCA分析可视化Beta多样性，以表征细菌群落结构差异及与养分指标的相关性。通过‘vegan’包进行PERMANOVA分析。利用R 4.2.2筛选相对丰度总和高于0.5%的物种，使用‘psych’包进行相关性矩阵分析，选择Spearman相关性系数r > |0.6|且显著性P < 0.01的数据进行网络构建，导入Gephi使用Fruchterman Reingold算法布局，计算模块化系数，得到主要的四个模块绘制网络图，并在R 4.2.2中统计四个模块的主要微生物组成。同时使用‘microeco’包计算网络属性和网络模块，提取节点模块内连通度（Zi）和模块间连通（Pi），绘制Zi-Pi图。采用Pearson相关性分析表征网络模块与环境因子的相关性。

2 结果 2.1 长期不同施肥处理对土壤养分的影响

经过长期不同施肥处理后，相比于秸秆移除且不施氮肥（T1），秸秆还田配施氮肥（T4和T5）显著降低土壤pH，增加SOC、TN、TP、AP、AK和${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$含量（表 1）。秸秆移除且不施氮肥（T1）的SOC含量显著低于其他处理；与秸秆移除且不施氮肥（T1）相比，秸秆与24%有机氮肥混埋田间处理（T8）的增碳效果最优，显著提高了42.06%SOC含量；在秸秆掩埋配施不同含量的氮肥处理中，配施有机氮肥处理（T6 ~ T8）的SOC含量高于无机氮肥处理（T9~T11）。通过比较TN含量，发现仅进行秸秆还田处理难以维持土壤TN含量，还需有外源氮素输入才能累积土壤TN；与不施氮肥处理（T1和T2）相比，秸秆掩埋配施氮肥处理能更有效地促进土壤氮素累积。秸秆移除处理（T1和T3）的${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$含量显著低于其他处理。

2.2 长期不同施肥处理对土壤细菌多样性和群落组成的影响

各处理中土壤细菌Alpha多样性有波动，但未达显著水平（P > 0.05，表 2），即不同秸秆还田方式和施氮方式对土壤细菌群落多样性无明显影响。基于Bray-Curtis距离矩阵的主成分分析（PCA）结果表明所选变量解释了细菌群落变异的62.25%，PC1轴解释了总变异的48.39%，PC2解释了总变异的13.86%（图 1）。秸秆移除或不施氮肥处理（T1、T2和T3）在PC1轴上与其他处理的细菌结构明显分离。土壤养分因子pH、SOC和TN、${\text{NH}}_{\text{4}}^ + {\text{ - N}}$等驱动了细菌群落结构变异。其中pH主要显著影响秸秆移除或不施氮肥处理（T1、T2和T3）的群落结构，SOC、TN等因子主要驱动秸秆还田（覆盖或掩埋）并配施氮肥处理的群落结构变异。通过PERMANOVA进行差异显著性检验并使用BH方法校正P值，结果验证了秸秆移除或不施氮肥处理（T1、T2和T3）与其他处理之间差异均达到显著水平（P < 0.01，表 3）。

细菌在门水平上的物种组成如图 2a所示。第一优势菌门为酸杆菌门（Acidobacteriota），平均相对丰度22.81%，秸秆覆盖不施氮肥处理（T2）显著（P < 0.05）高于其他处理；第二优势菌门为变形菌门（Proteobacteria），平均相对丰度19.64%，在秸秆移除且不施氮肥处理（T1）的丰度显著（P < 0.05）低于其他处理；第三优势菌门为拟杆菌门（Bacteroidota），平均相对丰度14.02%，在秸秆覆盖条件下，施氮肥处理（T4）显著（P < 0.05）高于不施氮肥处理（T2）；绿弯菌门（Chloroflexi）的平均相对丰度为11.04%，在秸秆移除条件下，施氮肥处理（T3）显著（P < 0.05）高于不施氮肥处理（T1）。其他优势菌门包括放线菌门（Actinobacteriota）、浮霉菌门（Planctomycetota）、疣微菌门（Verrucomicrobiota）、芽单胞菌门（Gemmatimonadota）、黏菌门（Myxococcota）和Methylomirabilota。

在科分类水平上（图 2b），相对丰度最高的科为Vicinamibacteraceae、厌氧绳菌科（Anaerolineaceae）、Pyrinomonadaceae、微颤蓝细菌科（Microscillaceae）和亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）。与秸秆移除处理（T1和T3）相比，秸秆还田处理均增加了Vicinamibacteraceae的相对丰度。而秸秆移除且不施氮肥（T1）的Anaerolineaceae和Pyrinomonadaceae的相对丰度显著高于其他处理。

2.3 土壤细菌群落的共现网络

基于测序得到的细菌ASVs，保留相对丰度总和高于0.5%的1 216个ASVs创建共现网络，得到4个主要的生态集群（图 3）。网络的平均度5.516，平均聚类系数0.643，平均路径长度4.566，模块化系数1.762。细菌网络中酸杆菌门和变形菌门是占据节点较多的类群。

通过Zi-Pi图（图 4a）可以发现网络大部分点均分布在模块边缘（Peripheral nodes），网络中心点包括10个模块中心点（Module hubs，Zi > 2.5且Pi < 0.62），包括拟杆菌门的Microscillaceae和酸杆菌门的Vicinamibacteria等，28个连接节点（Connectors，Zi < 2.5且Pi > 0.62），包括酸杆菌门的Vicinamibacteraceae、变形菌门的Xanthomonadaceae和Comamonadaceae、拟杆菌门的Microscillaceae和Chitinophagaceae等（表 4）。这些关键节点物种在维持网络模块的稳定性上具有重要作用。

采用Pearson相关性热图分析评估了共现网络中4个主要模块与土壤养分之间的关系。相关性分析结果（图 4b）表明，模块1内物种丰度与SOC、TN、TP、${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$、AP和AK呈极显著负相关（P < 0.001），与pH呈显著正相关（P < 0.001）；模块2内物种丰度与SOC、TN、TP、${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$、AP和AK呈极显著正相关（P < 0.001），与pH呈显著负相关（P < 0.01）；模块3内物种丰度与SOC（P < 0.05）、TN（P < 0.01）、TP（P < 0.001）、${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$（P < 0.05）、AP（P < 0.01）和AK（P < 0.05）呈显著正相关，与pH呈显著负相关（P < 0.05）；模块4物种丰度与SOC（P < 0.01）、TN（P < 0.01）、TP（P < 0.001）、AP（P < 0.01）和AK（P < 0.05）呈显著正相关。以上结果说明不同秸秆还田方式可以通过改变土壤养分含量改变细菌种群的生态关系，促进特定种群生长，从而进一步改变土壤养分循环过程。

3 讨论

本试验结果可以看出，秸秆还田处理显著提高土壤SOC、氮素、AP和AK养分含量（表 1），这与前人^[17-18]的研究结果基本一致，秸秆中丰富的养分刺激微生物活性，促进其分解有机物料并释放养分，也可同化养分形成微生物量碳氮，以微生物残体形式固存于土壤^[19]。秸秆掩埋配施适量氮肥处理对提高SOC含量效果更显著，其原因可能是秸秆掩埋可以避免其分解过程中以CO₂形态进入大气中^[20]，并且掩埋同时添加适量氮素，调节体系C/N比，提高微生物活性，促进秸秆深层腐解，因此有利于土壤SOC的累积^[21]。秸秆掩埋配施有机氮肥处理SOC含量高于无机氮肥处理，其原因可能是无机氮肥为速效氮肥，易挥发或淋溶，难以可持续地为秸秆腐解过程提供氮素养分；而有机氮肥中本身含有丰富的有机质，直接补充土壤有机碳库，并且其含有促腐微生物，可以促进秸秆转化过程，增加土壤SOC含量^[22]。本试验结果还表明，秸秆掩埋配施氮肥处理能更有效地提高土壤氮素、AP和AK含量，可能是因为秸秆本身可以补充土壤NPK养分，且秸秆还田能够固定氮肥^[23]，秸秆降解过程中频繁的生物转化促进磷钾释放。已有研究^[24-25]通过田间试验或室内培养试验验证了秸秆还田可以促进土壤有机态氮矿化，加速氮循环，提高氮素利用率，并且秸秆转化过程中产生的有机酸可以促进土壤磷的释放，从而减少化肥施用。

土壤中大量的细菌在土壤养分循环和秸秆腐解过程中起着关键作用^[26]，反之养分的变化会驱动特定的细菌群落形成^[27]。PCA分析说明了在不同秸秆还田方式和施氮水平处理下，土壤养分的变化明显改变了细菌群落的结构（图 1）。PERMANOVA结果验证了秸秆还田且施氮肥处理与其他处理的细菌群落结构有显著差异（表 3）。Fierer等^[28]的研究结果表明施用氮肥对细菌多样性影响不大，显著影响细菌群落结构，促进富营养型细菌类群的相对丰度增加，降低贫营养型细菌丰度，这与本研究结果一致。酸杆菌门、变形菌门、拟杆菌门、绿弯菌门和放线菌门是12个处理土壤细菌群落的主要优势菌门（图 2）。处理间优势菌群的相对丰度在存在一定差异。已有研究表明酸杆菌门的相对丰度随着pH的降低而增加^[29]。因此在不施氮肥条件下，秸秆覆盖处理的pH较低，其酸杆菌门相对丰度显著高于秸秆移除处理。变形菌门是富营养型细菌，适合生活在含碳量丰富的环境中且有利于土壤氮素转化过程^[30]。因此在施氮肥条件下，秸秆覆盖处理中变形菌门的相对丰度显著高于秸秆移除处理。在秸秆覆盖条件下，相比于不施氮处理，施氮处理中富营养型拟杆菌门相对丰度较高，其得益于较高的有机碳和氮素含量，这与前人的研究结果一致^[31]。

本研究发现，共现网络中的酸杆菌门和变形菌门占关键节点的1/2（图 3b），说明酸杆菌门和变形菌门是维持细菌网络稳定性的关键类群。细菌网络模块物种丰度与多个土壤养分指标呈显著相关性，尤其是模块1和模块2内的细菌群落（图 4b）。模块1中的物种丰度均与大部分土壤养分指标呈显著负相关，说明模块1中的物种适宜生长在养分含量较低的环境。土壤养分含量增加有利于富营养型细菌的生长，使其占据土壤中较多生态位，从而抑制了贫营养型细菌生长。网络模块1中相对丰度较高的酸杆菌门，以及关键物种Blastocatellia（ASV215）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae，ASV632和ASV905）已被证实偏好生长在营养较匮乏的环境中（表 4），其与SOC呈显著负相关关系，能够分解复杂的有机物料，在SOC含量不足或秸秆分解后期起着重要作用^[32-33]。在模块2、3和4中酸杆菌门相对丰度显著降低，其他种群相对丰度升高，因此三个模块与土壤养分指标的相关性关系发生了变化。模块2、3物种丰度与SOC、TN、TP、AP和AK均呈现显著正相关关系，说明两模块中的关键物种在秸秆降解过程中起着积极作用，促进秸秆养分向土壤养分转化，在土壤养分循环方面发挥重要作用。比如模块2中的ASV972和模块3中的ASV1097归属于黄单胞菌科（Xanthomonadaceae），能通过分解木质素作为自身碳源生长^[34]；属于贫营养型酸杆菌门的Vicinamibacteria是模块2、3、4共有的关键种群，可能其生长有广泛的适应性并能够分解土壤中的复杂大分子有机物^[35]；模块3中特有的关键物种ASV452属于浮霉菌门；该菌门被证实包含大量的厌氧氨氧化菌，能够促进氮循环的氨氧化过程^[36]，从而影响土壤中${\text{NH}}_{\text{4}}^ + {\text{ - N}}$和${\text{NO}}_{\text{3}}^ - {\text{ - N}}$含量；拟杆菌门包含一些能够分泌磷酸酶和有机酸的菌属，可促进土壤难溶性磷的转化，提高磷有效性^[37]；属于酸杆菌门的Holophagae（ASV851）、黏菌门（Myxococcota，ASV692）属于稀有类群，但其和Verrucomicrobiota（ASV450）是模块2、3和4中重要的连接节点，说明这些物种可以通过频繁参与土壤养分交换过程，在土壤养分循环过程发挥多重作用^[38]。因此，通过比较网络模块中关键物种差异，可以为土壤肥力定向培育提供参考，作为优化土壤培肥技术的生物依据^[39]。通过促进与养分含量呈正相关的关键物种生长，可改变土壤细菌群落结构和生态关系，进而影响土壤演替方向及改善土壤肥力。

4 结论

长期秸秆掩埋配施适量氮肥（T5 ~ T12）能够增加土壤养分含量，提升土壤肥力，并改变细菌群落结构。pH，SOC和TN等养分指标是影响细菌群落结构的重要因素。网络分析得到4个主要的生态集群，模块2、3和4中的Verrucomicrobiota（ASV450）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae，ASV972和ASV1097）和丛毛单胞菌科（Comamonadaceae，ASV632和ASV905）等物种可以参与养分转化过程。通过以上研究，长期秸秆掩埋配施氮肥有利于华北地区农田土壤肥力的提升，优化细菌群落结构，促进土壤养分循环。