盐渍土是一系列受盐碱成分作用的,包括不同程度盐化和碱化的各种类型土壤的统称,也称为盐碱土[1]。土壤盐渍化因其高盐渗透作用,腐蚀植被根系,影响农作物吸收水分,还会导致土壤理化性质恶化,影响农作物生长,是目前农业生产以及生态环境面临的世界性难题之一[2]。目前,盐碱地改良方法主要有物理改良、化学改良和生物改良[3]。虽然在盐碱土改良方面,物理和化学手段已经取得了很大的成就,但其工作量大、成本高等缺陷也不容忽视[4],而生物改良技术因具有高效、环保、经济效益高等优点[5],近年来得到了广泛关注。
已有相关研究利用微藻或细菌来改良盐渍化土壤,结果表明,微藻和细菌可通过产生胞外聚合物与盐离子螯合[6],从而有效降低土壤盐分。利用微生物改良盐渍化土壤虽然是一种绿色可持续的有效方法,但单一施用微藻或细菌对土壤的改良效果有限[7],此外,微藻在农业上的应用还具有生长周期长、生产效率低等问题[8]。自然环境中藻菌之间存在直接或间接的相互作用,对藻菌的逆境抵御和生理功能等方面具有重要影响,因而微藻-细菌共生在环境修复中的应用往往优于单一微生物的应用。周璇等[9]发现某些产VB12细菌在与莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)共生时,可以显著地增强衣藻的耐热能力。张波等[10]探究藻菌共生体系对造纸废水的处理效果时发现,水单胞菌(Aquimonas sp.)与棕鞭藻(Ochromonas sp.)藻菌共生体系对造纸废水中化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)、总氮量(total nitrogen,TN)、总磷量(total phosphorus,TP)及色度的去除效果显著优于纯藻和纯菌处理体系,去除率最高分别达75.67%、35.19%、90.2% 和93.45%。张慧洁等[11]研究发现相较于单一微藻或细菌,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和小球藻(Chlorella vulgaris)配施处理更有利于改善土壤微生物群落结构,刺激土壤微生物活性提高土壤磷有效性。由此可见,微生物之间互惠互利的共生关系可以进一步增强各自的能力,尽管如此,国内外的研究大多局限于单一微藻或细菌,利用藻菌联合作用改良盐渍化土壤的相关研究较少。
因此,本研究从华北平原盐渍化土壤中分离筛选得到耐盐藻菌组合,利用液相实验,分析其对盐胁迫的响应。通过向盐渍化土壤表层接种耐盐藻菌组合,进一步探究藻菌联合对盐渍化土壤的生物改良作用。研究结果将为盐渍化土壤治理和修复提供新的改良途径和理论依据。
1 材料与方法 1.1 盐渍化土壤藻株和菌株的分离与培养从河北省沧州市(37°49′~38°10′N,116°32′~117°01′E)盐渍化土壤表面采集样品,将10 g土壤样品置于灭菌后的锥形瓶中,加入BG-11液体培养基,置于24 ℃、光照强度为8 000 Lux、光/暗比为16/8的光照培养箱中富集培养[12]。待土壤样品表面明显变绿后,用平板稀释涂布法将藻液涂布至固体BG-11培养基上进行分离、纯化,得到单种藻细胞。继续用液体BG-11培养基扩大培养,显微观察藻细胞形态,得到了5株纯种的藻体。镜检显示藻1为真核藻类,其余4种藻株均为原核藻类。
称取土壤样品10 g,加入无菌水,制成10–1、10–2、10–3和10–4的土壤样品稀释液。分别吸取200 μL的稀释液加入无菌LB平板中,涂布均匀后倒置于37 ℃的培养箱。待长出菌落后,挑取单菌落接种到新的培养基中培养,待菌苔长出后,检查其形态特征是否一致,若发现有杂菌,则再进行一次分离和纯化[13]。经过3次的分离和纯化后,获得了10种菌株。
1.2 藻株和菌株耐盐预筛选及耐盐藻菌组合的筛选(1)藻株的耐盐筛选。将从盐渍化土壤中分离得到的5种藻株的富集培养液经离心收集后,接种至NaCl浓度为5 g·L–1的BG-11液体培养基中培养7 d。以OD680 nm表征藻株的生物量[14],通过比较盐胁迫下5种藻株的生物量及比生长率变化,筛选出藻1、藻2和藻5作为耐盐藻株材料。
(2)菌株的耐盐筛选。将盐渍化土壤中分离得到的10种菌株经富集培养后离心收集,接种至NaCl浓度为20 g·L–1的BG-11液体培养基中培养7 d。以OD600 nm表征菌株的生物量[15],通过比较盐胁迫下10种菌株的生物量及比生长率变化,筛选出菌1、菌5、菌6和菌8作为耐盐菌株材料。
(3)耐盐藻菌组合的筛选。耐盐藻株和耐盐菌株分别组成藻菌组合,接种至BG-11液体培养基中培养7 d。采用丙酮提取—紫外分光光度法测定藻株光合色素含量:取培养液5 mL,离心后去上清,加入90%的丙酮进行提取,测定663 nm、645 nm和450 nm下的OD值:
| $\text{叶绿素a含量}^{[16]}\left(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{L}^{-1}\right)=\left(12.72 \times \mathrm{OD}_{663 \mathrm{~nm}}-2.7 \times \mathrm{OD}_{645 \mathrm{~nm}}\right) \times V_t / V $ | (1) |
| $\text{类胡萝卜素含量}^{[17]}\left(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{L}^{-1}\right)=4.1 \times \mathrm{OD}_{450 \mathrm{~nm}}-0.0435 \times\text{叶绿素a含量} $ | (2) |
式中,Vt为提取后定容的体积,V为提取所用的藻液体积。
通过比较各藻菌组合中藻株的光合色素含量变化,分别筛选与藻1、藻2和藻5联合耐盐能力最强的菌株,组成耐盐藻菌组合。
1.3 藻菌组合对盐胁迫的响应将3种耐盐藻菌组合接种至盐浓度为0、5、10、15和20 g·L–1的BG-11液体培养基中培养10 d。采用离心法分级提取胞外聚合物(EPS)。取5 mL培养液,10 000 r·min–1离心15 min,用0.45 μm微孔滤膜抽滤得到滤液,滤液通过苯酚-硫酸法测定EPS含量[18]。用多参数水质分析仪(YSI Pro Professional Plus,USA)测定培养液的盐度。
1.4 藻菌组合对盐渍化土壤的改良作用盐渍化土壤样品自然风干后,过0.78 mm筛网去除枯枝落叶及大颗粒杂质备用。设置空白对照组、微藻、细菌和藻菌组合处理组。定时用等量去离子水灌溉土壤使土壤含水率保持在40%左右,培养30 d后,测定土壤理化性质。采用碱性过硫酸钾氧化—紫外分光光度法[19]测定土壤总氮含量,苯酚-硫酸法测定土壤EPS含量。土壤样品烘干后按照土︰水=1︰5水土浸出比,制备土壤浸出液,用多参数水质分析仪测定土壤浸出液盐度和pH。
1.5 藻株和菌株基因组DNA的提取与鉴定采用SDS碱法提取藻株基因组DNA[20];使用碱-SDS-煮沸法提取菌株基因组DNA[21]。藻1引物序列为真核生物通用引物:18S-F(5′ACCTGG TTGATCCTGCCAGT3′)和18S-R(5′TCACCTA CGGAAACCTTGT3′)[20];菌8引物序列为细菌通用引物:27F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCA3′)和1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′)[22]。由生工生物技术有限公司合成。PCR反应体系为50 μL,其中含有引物(20 pmol)各1 μL,基因组DNA 1 μL,10×PCR Buffer 5 μL,dNTP(MgCl2)4 μL,Taq酶0.3 μL,其余以ddH2O补足。反应条件为:95 ℃、5 min;30个循环:94 ℃、30 s,50 ℃、1 min,72 ℃、1 min30 s;72 ℃延伸、10 min;4 ℃保存。对扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,在凝胶成像仪(培清JS-680B,上海)上观察,检测目的条带,并将目的产物送生工公司测序。利用BLAST在线工具与NCBI数据库的模式物种序列进行同源性比对,下载模式物种序列,采用MEGA(MEGA.11,Kumar Lab)软件,利用CLUSTALW对所有序列进行多序列的比对,再用系统邻接法(Neighbor-joining,NJ),设置100次的Bootstrap检验各分支的置信度,其他参数均为默认值,构建系统进化树,对藻株和菌株进行鉴定。
1.6 数据分析数据采用均值±标准偏差表示,采用SPSS 26(IBM Inc.,Chicago,IL,美国)进行独立样本T检验、方差齐性检验和单因素方差分析(ANOVA),P < 0.05被认为具有统计学意义,使用Origin 2021(Origin Lab Inc.,Northampton,MA,美国)作图。
2 结果 2.1 耐盐藻菌组合的筛选为了初步筛选最优的耐盐组合,对不同藻菌组合的微藻光合色素含量进行测定。结果表明,在不同组合藻1的叶绿素a和类胡萝卜素含量呈现出不同的变化趋势,藻1菌1组合中藻1的光合色素含量呈波动状态,藻1菌5、藻1菌6和藻1菌8组合中藻1的光合色素含量均呈上升趋势,其中藻1菌8组合的光合色素含量增势最为明显,叶绿素a和类胡萝卜素含量分别增长了15.54倍和8.65倍(图 1a和图 1d)。藻2也呈现出不同的变化趋势,藻2菌5、藻2菌6、藻2菌8组合光合色素含量均呈波动状态,藻2菌1组合光合色素含量增长稳定,叶绿素a和类胡萝卜素含量分别增长了1.43倍和1.13倍(图 1b和图 1e)。藻5在4种组合的叶绿素a含量均稳定上升,藻5菌1、藻5菌5、藻5菌6组合类胡萝卜素含量增长趋势较为波动,其中藻5菌8组合光合色素含量增长稳定,叶绿素a和类胡萝卜素含量分别增长了10.83倍和2.75倍(图 1c和图 1f)。综上,共筛选得到藻1菌8、藻2菌1和藻5菌8三种藻菌组合。
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注:a),b)和c)分别为藻1,2和5与菌1,5,6和8组合的叶绿素a含量;d),e)和f)分别为藻1,2和5与菌1,5,6和8组合的类胡萝卜素含量。 Note: a), b)and c)represent Chl.a contents of algae 1, 2 and 5 with bacteria 1, 5, 6 and 8, respectively; d), e)and f)represent carotenoids contents of algae 1, 2 and 5 with bacteria 1, 5, 6 and 8, respectively. 图 1 藻菌组合光合色素的含量 Fig. 1 The contents of photosynthetic pigments in different algae-bacterial consortia |
为了探究藻菌联合对盐胁迫的响应,对各盐浓度下不同藻菌组合EPS分泌量进行测定。结果表明,在不同浓度盐胁迫下,各处理组EPS分泌量呈现不同的变化。藻1在20 g·L–1 NaCl处理下EPS分泌量显著增加,增加了98.46%(P < 0.05,图 2a);菌8在15 g·L–1 NaCl处理下EPS分泌量显著增加,增加了24.73%(P < 0.05,图 2b);藻1菌8组合在15和20 g·L–1 NaCl处理下EPS分泌量均显著增加,分别增加了44.56%和43.19%(P < 0.05,图 2c)。在各浓度盐胁迫下,藻2和菌1的EPS分泌量均显著增加(P < 0.05,图 2d和图 2e);在5和10 g·L–1 NaCl处理下,藻2菌1组合EPS分泌量显著增加,而在高盐处理下其EPS分泌量无显著变化(P < 0.05,图 2f)。藻5在5和10 g·L–1 NaCl处理下EPS分泌量显著增加,分别增加了25.68%、26.87%(P < 0.05,图 2g);而菌8及藻5菌8处理组均出现了EPS分泌量显著下降的情况(P < 0.05,图 2h和图 2i)。
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注:a),b)和c)分别表示藻1,菌8和藻1菌8联合处理;d),e)和f)分别表示藻2,菌1和藻2菌1联合处理;g),h)和i)分别表示藻5,菌8和藻5菌8联合处理;* 表示P < 0.05。 Note:a),b)and c)represent the treatment of algae-1,bacteria-8 and algae1-bacteria8 consortium,respectively;d),e)and f)represent the treatment of algae-2,bacteria-1 and algae2-bacteria1 consortium,respectively;g),h)and i)represent the treatment of algae-5,bacteria-8 and algae5-bacteria8 consortium,respectively;* represents P < 0.05. 图 2 培养液中微生物分泌的胞外聚合物(EPS)的变化 Fig. 2 Changes of EPS secreted by microorganisms in culture medium |
图 3显示,在不同盐浓度梯度下,各处理组的可溶性盐含量均显著下降(P < 0.05)。在5、10、15和20 g·L–1 NaCl浓度下,藻菌联合及藻处理组可溶性盐含量均显著低于菌处理组(P < 0.05,图 3)。此外,在藻1菌8处理中,藻菌联合处理组在20 g·L–1 NaCl浓度下可溶性盐含量显著低于藻处理组(P < 0.05,图 3a)。各藻菌联合处理组在各盐度下的去盐结果表明,在10 g·L–1 NaCl浓度下,藻1菌8和藻2菌1联合处理组的去盐率均显著高于藻5菌8处理组,去盐率分别为57.57%和57.29%(P < 0.05,图 4);在15 g·L–1 NaCl浓度下,藻1菌8联合处理组的去盐率显著高于藻2菌1和藻5菌8处理组,去盐率达57.89%(P < 0.05,图 4);在20 g·L–1 NaCl浓度下,藻1菌8和藻5菌8联合处理组的去盐率均显著高于藻2菌1处理组,去盐率分别为57.55%、57.79%(P < 0.05,图 4)。由此,藻1菌8组合在高盐环境中表现出稳定高效的去盐能力,筛选其开展后续的试验。
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注:a)表示藻1,菌8和藻1菌8联合处理;b)表示藻2,菌1和藻2菌1联合处理;c)表示藻5,菌8和藻5菌8联合处理;不同字母表示不同处理间的显著性差异(P < 0.05)。Note:a)represents the treatment of algae-1,bacteria-8 and algae1-bacteria8 consortium,respectively;b)represents the treatment of algae-2,bacteria-1 and algae2-bacteria1 consortium,respectively;c)represents the treatment of algae-5,bacteria-8 and algae5-bacteria8 consortium,respectively;different letters represent significant differences between treatments at the 0.05 level. 图 3 不同藻菌处理对液态环境中可溶性盐含量的影响 Fig. 3 Effects of different algal and bacterial treatments on soluble salt content in liquid environment |
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注:不同字母表示不同处理间的显著性差异(P < 0.05)。 Note: different letters represent significant differences between treatments at the 0.05 level. 图 4 不同藻菌组合盐分去除率的比较 Fig. 4 Comparison of desalting rate at different algae-bacterial consortia |
通过测序比对,结果表明,藻1与Borodinellopsis sp. QY-2024a(PP544782.1)高度相似,序列相似性可达99.94%,结合其形态学特性,鉴定其属于绿球藻目中的Borodinellopsis sp.[23](图 5a和图 5b)。菌8与Bacillus sp. hb11(KF863811.1)高度相似,序列相似性可达99.92%,结合其形态学特性,鉴定其属于芽孢杆菌属(Bacillus)(图 5c和图 5d)。
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注:a)表示藻1显微镜检照片;b)表示藻1的系统进化树;c)表示菌8的形态特征;d)表示菌8的系统进化树;各分支上的数值为Bootstrap值。Note:a)represents the microscopic image of algae-1;b)represents the phylogenetic tree of algae-1;c)represents the morphological characteristics of bacteria-8;d)represents the phylogenetic tree of bacteria-8;the values on each branch represent Bootstrap values. 图 5 藻1和菌8形态及系统邻接进化树 Fig. 5 Morphology and neighbor-joining phylogenetic tree of algae-1 and bacteria-8 |
将藻1、菌8及藻1菌8组合接种至盐渍化土壤中,探讨其对土壤理化性质的影响。结果显示,单独接种菌8的土壤pH为7.44,显著低于初始值和空白组,其他处理组均无显著变化(P < 0.05,图 6a)。藻1、菌8和藻1菌8处理组土壤浸出液盐度较空白均显著下降,分别降低了5.10%、3.45%和7.00%,其中藻1菌8的土壤浸出液盐度显著低于单独接种藻或菌的土壤(P < 0.05,图 6b)。藻1、菌8及藻菌联合处理组土壤EPS含量均显著增加,分别增加了51.72%、8.20%和185.88%(P < 0.05,图 6c)。藻菌联合处理组土壤中的全氮含量显著高于空白含量,提高了55.33%,而接种单一藻或菌的土壤全氮含量无显著变化(P < 0.05,图 6d)。
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注:不同字母表示不同处理间的显著性差异(P < 0.05),* 表示P < 0.05。Note:different letters represent significant difference between treatments at the 0.05 level,* represents P < 0.05. 图 6 藻1、菌8及联合作用下土壤理化性质的变化 Fig. 6 Changes of soil physicochemical properties at treatments of algae-1, bacteria-8, and their consortium |
盐胁迫下微藻和细菌分泌的EPS,一方面可作为渗透保护屏障,保护细胞免受外界高渗环境的影响[24],提高其对高盐环境的适应能力;另一方面,其能与盐离子发生反应,降低液态环境中盐分含量[25]。本研究发现,在高盐环境中,微藻和细菌能分泌较高浓度的EPS以降低盐分的胁迫,这与段会杰[7]的研究结果一致。此外,本研究还发现,藻1菌8组合在20 g·L–1 NaCl浓度下的去盐效果优于单独的藻或菌。该结果支持了先前的研究,如:Gu等[26]发现藻类可通过光合作用为细菌提供额外的有机碳源、生长因子、O2等,促进其生长;张哲[27]发现细菌呼吸以及将大分子有机物水解产生的CO2能供微藻进行光合作用,在盐胁迫下有效促进微藻的生长。这表明藻1菌8联合,可能通过调节有机碳源和光合作用来提高二者在高盐环境中的活性。
3.2 藻菌联合对盐渍化土壤理化性质的影响土壤pH直接关系到土壤肥力,进而影响作物生长。适量的碱性可以提高土壤中的有效养分含量,有利于作物的生长和发育[28],然而过高的碱性也可能导致土壤中的某些营养元素变得不可利用,从而限制作物的生长[29]。本研究发现单独接种菌8的土壤pH显著降低,这支持了唐岷宸等[30]的研究。他们发现某些芽孢杆菌能够通过代谢产生多种有机酸如乙酸、草酸等,由此,推测有机酸的分泌可能是菌8降低土壤pH的原因之一。同时,本研究表明单独接种藻1土壤pH无显著变化,这与崔丽洋等[25]的研究结果一致,说明单独应用微藻对土壤酸碱性的改良效果不明显。尽管多项研究表明藻菌联合应用会使土壤pH升高[7-8],但本研究发现接种藻菌组合的土壤pH无显著变化,这表明本研究筛选得到的藻菌组合不会加重盐渍化土壤的碱性,使得利用其改良盐渍化土壤更具可行性。
土壤盐度过高会限制植物的吸水和蒸腾,降低土壤肥力,导致农作物减产[31]。结果表明,藻1、菌8和藻1菌8联合均能够降低土壤盐度,起到改善土壤性质的作用,并且藻菌联合对盐渍化土壤的改良效果优于单独应用藻或菌的效果。Arp等[6]同样发现微藻和细菌可以通过直接吸收或分泌EPS等物质固定土壤中的盐分,从而降低土壤盐度,此外,微藻和细菌还能分泌促生激素[7]并为彼此提供营养物质[32]。因此在藻菌联合应用中,二者间的相互作用可以促进彼此的生长及生物活性,提高微藻和细菌的降盐能力。
微生物产生的EPS与土壤结皮、土壤团聚体稳定性等性质密切相关[33]。Mishra和Jha[34]证实,EPS中的部分官能团如-OH、-COOH、-NH2和-C=O等能络合盐离子,一定程度上能够限制土壤中盐分的迁移,减少盐分对微生物和植物的影响。此外,EPS能够通过静电引力和范德华力包被在土壤颗粒外表,通过增加土壤颗粒的黏结性来促进团聚体的形成[35],土壤团聚体的形成和稳定可以进一步促进土壤孔隙结构的发育,改善土壤结构[36],增加土壤有机质含量,提高土壤肥力[37]。在本研究结果中,藻1、菌8及藻菌联合处理组土壤EPS含量均显著增加,表明接种微藻或细菌能够起到改善土壤性质的作用。
盐渍化土壤中氮含量较低[7],不利于植物的吸收和利用。本研究发现,接种单一藻或菌的土壤全氮含量无明显变化,而接种藻菌组合的土壤全氮含量显著升高。吴志宇[38]、胡应平[39]等研究表明,某些芽孢杆菌具有一定的固氮能力,由此,推测在藻菌联合应用中,藻1和菌8间的相互作用提高了菌8的固氮能力,从而增加土壤含氮量,改善土壤肥力。
4 结论从华北地区盐渍化土壤中分离纯化得到5种藻株和10种菌株,并进行耐盐初筛及共生能力复筛,再通过探究藻菌组合对盐胁迫的生理生化响应进一步筛选出藻1菌8为最优组合。经鉴定,藻1为Borodinellopsis sp.,菌8为芽孢杆菌属(Bacillus)。在盐胁迫下,Borodinellopsis、芽孢杆菌及藻菌组合均表现出较强的耐盐能力及促生物质分泌能力。高盐环境中,藻菌联合相较于单独的藻或菌,对溶液中可溶性盐的去除效果更佳。此外,藻菌组合在高盐胁迫下胞外聚合物分泌量显著增加,其抵抗盐胁迫的能力较强。将Borodinellopsis、芽孢杆菌及藻菌组合分别接种于盐渍化土壤表面,结果发现,藻菌联合可有效降低土壤盐度,增加土壤胞外聚合物含量,提高土壤全氮含量,且相较于单一应用微藻或细菌改良,藻菌联合对盐渍化土壤的改良效果更加明显。
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