王丰
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刘灵芝
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刘蕊
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郭冰清
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孟奥
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陈美慧
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安婷婷
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汪景宽
摘要:
病毒在土壤微生物群落结构及宿主动态调控中发挥重要作用。受土壤环境复杂性影响,土壤病毒的有效提取和计数仍然面临诸多挑战。本研究通过病毒提取和显微观察条件优化,提高土壤病毒荧光显微检测的效率。选取沈阳农业大学棕壤长期定位施肥实验站土壤,评估三种关键因素对土壤病毒提取效率及荧光显微计数结果的影响:(1)防荧光淬灭方法(防淬灭剂Fluoromount-GTM和实验室制备防褪色剂);(2)破碎方式(手持搅拌棒、涡旋混合器、超声波细胞粉碎机、水浴摇床);(3)土壤与提取液比例(30:100和50:100;w:v)。采用SYBR Green I核酸染料对病毒颗粒进行染色,并利用荧光显微镜观察和计数。将所得优化方案应用于棕壤、黑土与草甸土,以验证其普遍性。结果表明:在荧光显微镜检测过程中,不使用任何防荧光淬灭剂(防褪色剂或防淬灭剂)时病毒颗粒在100×物镜下难以观察,而使用防淬灭剂(Fluoromount-GTM)后,病毒计数提升至3.75 × 108 virus-like particles(VLPs)?g-1,显著优于使用防褪色剂。此外,破碎方式显著影响病毒提取效率(P < 0.05),其中手持搅拌棒(650 W,50 Hz)处理3 min的提取效率最高,显著优于涡旋混合器和水浴摇床,而使用超声波细胞粉碎机未能检测到病毒颗粒。土液比的增加显著提升病毒提取效率(P < 0.05),土液比为50:100(w:v)时的病毒数量较30:100(w:v)时提高了1227.10%。三种类型土壤验证结果显示,优化方法在供试土壤中均能获得稳定、可靠的病毒计数结果,且不同类型土壤间病毒丰度差异显著。综上所述,本研究通过优化破碎方式、土液比及防淬灭剂选择,建立了一种高效、稳定且适用性较广的土壤病毒荧光显微计数方法,可有效提高土壤病毒的提取效率和荧光显微镜计数效果,为土壤病毒生态学研究提供技术支持。